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研究背景和目的:非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liverdisease, NAFLD)是指除酒精和其他明确的损肝因素所致外,以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要特征的临床病理综合征,包括非酒精性单纯性脂肪肝以及由其演变的非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholicsteatohepatitis, NASH)和肝硬化。其中NASH是以肝细胞丧失、脂肪变性、气球样变、炎性坏死及纤维化形成为特征的病理状态。 NASH常见于II型糖尿病、高血压、高脂血症及肥胖患者。NASH的发病机制非常复杂,且未完全阐明。目前被多数学者所接受的是1998年由Day CP所提出的“二次打击学说”。在“初次打击”诱发肝细胞脂质沉积的前提下,以氧化应激和炎症反应为轴心的“二次打击”在NASH的发生发展中起重要作用。NASH的持续存在已成为肝硬化甚至肝癌的重要因素之一。其中15%-20%的NASH患者在10-20年内可进展为肝硬化。随着中国物质生活水平的日益提高,NASH的患病人数持续增加,其年龄也呈现低龄化趋势。针对NASH的药物研究也成为当今医学研究的热点之一。气体信号分子硫化氢(H2S),作为一种气体递质,不需借助任何特殊的运输工具就可以自由快速地通过细胞膜, H2S在心血管、呼吸、消化、神经等系统中具有重要生理作用。研究发现H2S具有抗氧化应激、抗炎症反应,抗凋亡以及抗纤维化作用。内源性H2S是否参与NASH发病过程,现在尚无研究。本课题的研究目的就是阐明内源性H2S在大鼠NASH发病过程中的变化;并进一步通过给以外源性的H2S进行治疗,阐明H2S在大鼠NASH发病过程中的作用,同时为NASH的药物研究提供基础。方法:第一部分:观察大鼠NASH发病过程中内源性H2S的变化营养诱发动物模型(食物喂养法)是NASH动物模型建立最常用的方法。其中蛋氨酸/胆碱缺乏饲料(,methionine-choline deficient diet,MCD)和高脂饲料(high-fatdiet,HFD)为诱导NASH的两种常见饲料。1. MCD诱导形成NASH大鼠模型,分1天,7天,3周,6周,8周时间梯度观察血清中H2S水平,肝脏中H2S的生成能力;应用RT-PCR法和Western blotting法考察肝脏中H2S生成酶如胱硫醚-β-合酶(CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)的基因转录和蛋白表达的变化。2. HFD诱导形成NASH大鼠模型,分1天,7天,3周,6周,8周时间梯度观察血清中H2S水平,肝脏中H2S的生成能力;应用RT-PCR法和Western blotting法分别考察肝脏中H2S生成酶如CBS和CSE的基因转录和蛋白表达的变化。第二部分:外源性H2S对大鼠NASH肝损伤的保护作用1.MCD诱导形成NASH大鼠模型,同时腹腔注射硫氢化钠(NaHS,H2S供体)治疗8周,观察肝脏病理损伤、肝功能损伤指标;观察肝细胞凋亡情况。2.HFD诱导形成NASH大鼠模型,同时腹腔注射硫氢化钠(NaHS,H2S供体)治疗8周,观察肝脏病理损伤、肝功能损伤指标;观察肝细胞凋亡情况。第三部分:H2S大鼠缓解NASH肝损伤的作用机制1.MCD诱导形成NASH大鼠模型,同时腹腔注射硫氢化钠(NaHS,H2S供体)治疗8周,观察氧化应激相关指标与炎症反应相关指标;观察肝脏脂质沉积以及脂肪酸代谢基因表达;2.HFD诱导形成NASH大鼠模型,同时腹腔注射硫氢化钠(NaHS,H2S供体)治疗8周,观察氧化应激相关指标与炎症反应相关指标;观察肝脏脂质沉积以及脂肪酸代谢基因表达;结果:第一部分:大鼠NASH发病过程中内源性H2S的变化1. MCD饲料诱导形成NASH大鼠模型,3周后,血清和肝脏中H2S水平降低,肝脏中CBS和CSE的mRNA水平和蛋白表达水平下降。2. HFD诱导形成NASH大鼠模型,6周时,发现血清和肝脏中H2S水平降低,肝脏中CBS和CSE的mRNA水平和蛋白表达水平下降。第二部分:外源性H2S对大鼠NASH肝损伤的保护作用1. MCD饲料诱导形成NASH大鼠模型,同时腹腔注射硫氢化钠(NaHS,H2S供体)治疗8周。(1)病理检测:HE染色见正常对照组大鼠肝小叶结构完整,肝索排列整齐,肝细胞大小均匀,无变性坏死;MCD模型组大鼠肝脏肝小叶失去正常结构,肝板排列紊乱,肝细胞普遍脂肪变性,炎症坏死及出血明显,炎症细胞侵润,肝细胞气球样变。H2S治疗组炎症细胞侵润和肝细胞气球样变得到明显减轻。(2)凋亡检测:TUNEL检测发现MCD模型组大鼠肝脏中凋亡细胞数目增加。H2S治疗组与模型组相比,凋亡细胞数目减少。(3)肝脏损伤指标:MCD模型组大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平增加;H2S治疗组与模型组相比,ALT和AST水平降低。2. HFD诱导形成NASH大鼠模型,同时腹腔注射硫氢化钠(NaHS,H2S供体)治疗8周。(1)病理检测:HE染色见正常对照组大鼠肝小叶结构完整,肝索排列整齐,肝细胞大小均匀,无变性坏死;HFD模型组大鼠肝脏肝小叶失去正常结构,肝板排列紊乱,肝细胞普遍脂肪变性,炎症坏死及出血明显,炎症细胞侵润,肝细胞气球样变。H2S治疗组炎症细胞侵润和肝细胞气球样变得到明显减轻。天狼星红(Sirius Red)染色发现HFD模型组大鼠脏肝纤维化明显,H2S治疗大鼠脏肝纤维化得以缓解。(2)凋亡检测:TUNEL检测发现HFD模型组大鼠肝脏中凋亡细胞数目增加;H2S治疗组与HFD模型组相比,凋亡细胞数目减少。(3)肝脏损伤指标:HFD模型组大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平增加;H2S治疗组与模型组相比,ALT和AST水平降低。(4)胰岛素耐受:HFD模型组大鼠空腹血糖水平增加,空腹胰岛素水平变化不明显,胰岛素抵抗指数增加;H2S治疗降低了HFD模型组大鼠的空腹血糖水平,降低了胰岛素抵抗指数。第三部分:外源性H2S大鼠缓解NASH肝损伤的作用机制1.MCD饲料诱导形成NASH大鼠模型,同时腹腔注射硫氢化钠(NaHS,H2S供体)治疗8周。(1)氧化应激相关指标:MCD模型组大鼠肝脏中丙二醛(MDA,脂质过氧化的标志分子)水平增加, CYP2E1和HO-1的mRNA和蛋白表达水平增加;H2S治疗组与模型组相比,MDA水平降低,CYP2E1的mRNA和蛋白表达水平降低,而HO-1的mRNA和蛋白表达水平进一步增加。(2)炎症反应相关指标:MCD模型组大鼠肝脏中TNFα和IL-6的mRNA和蛋白表达水平增加,细胞浆中IκBα蛋白水平降低,细胞核中NFκB p65蛋白水平增加。H2S治疗组与模型组相比,大鼠肝脏中TNFα和IL-6的mRNA和蛋白表达水平降低,细胞浆中IκBα蛋白水平增加,细胞核中NFκB p65蛋白水平减少。(3)肝脏脂质沉积以及相关脂肪酸代谢基因的表达:MCD模型组大鼠肝脏中胆固醇和甘油三脂的水平明显增加,PPARα, SREBP-1c, FAS,和L-FABP的mRNA水平降低,CD36, TLR-2和TLR-4的mRNA水平增加;H2S治疗降低了MCD模型组大鼠肝脏中胆固醇和甘油三脂的水平,增加了PPARα和L-FABP的mRNA水平,降低了CD36,TLR-2和TLR-4的mRNA水平,进一步降低了SREBP-1c和FAS的mRNA水平。2.HFD诱导形成NASH大鼠模型,同时腹腔注射硫氢化钠(NaHS,H2S供体)治疗8周。(1)肝脏损伤指标:HFD模型组大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平增加;H2S治疗组与模型组相比,ALT和AST水平降低。(2)氧化应激相关指标:HFD模型组大鼠肝脏中丙二醛(MDA,脂质过氧化的标志分子)水平增加, CYP2E1和HO-1的mRNA和蛋白表达水平增加;H2S治疗组与HFD模型组相比,MDA水平降低, CYP2E1的mRNA和蛋白表达水平降低,而HO-1的mRNA和蛋白表达水平进一步增加。(3)炎症反应相关指标:HFD模型组大鼠肝脏中TNFα和IL-6的mRNA和蛋白表达水平增加,细胞浆中IκBα蛋白水平降低,细胞核中NFκB p65蛋白水平增加。H2S治疗组与模型组相比,大鼠肝脏中TNFα和IL-6的mRNA和蛋白表达水平降低,细胞浆中IκBα蛋白水平增加,细胞核中NFκB p65蛋白水平减少。(6)肝脏脂质沉积以及相关脂肪酸代谢基因的表达:HFD模型组大鼠肝脏中胆固醇和甘油三脂的水平明显增加,PPARα, SREBP-1c, FAS,和L-FABP的mRNA水平降低,CD36, TLR-2和TLR-4的mRNA水平增加;H2S治疗降低了HFD模型组大鼠肝脏中胆固醇和甘油三脂的水平,增加了PPARα和L-FABP的mRNA水平,降低了CD36,TLR-2和TLR-4的mRNA水平,进一步降低了SREBP-1c和FAS的mRNA水平。结论:本课题探索了H2S在NASH(NASH)发病过程中的变化以及作用机制:一、在MCD或HFD诱导的NASH大鼠模型中,大鼠血液和肝脏中的H2S水平都减少。H2S水平的明显变化提示该分子可能参与NASH的发病过程。二、在MCD或HFD诱导的NASH大鼠模型中给以外源性H2S治疗发现,NASH的病变状态明显减弱,凋亡减少,胰岛素耐受情况得到好转(仅限于HFD诱导的NASH模型),肝脏中脂质沉积水平降低,氧化应激和炎症反应减轻。结果提示NASH过程中H2S水平的降低可能是NASH恶化的因素之一,内源性的H2S本身可能是体内的防御分子之一,提示了应用外源性H2S治疗NASH患者的潜在价值,为临床的H2S治疗应用提供理论依据。另外也广泛探讨了H2S作为一种肝脏保护分子的作用机制,其机制涉及对氧化应激,炎症反应,胰岛素耐受和脂肪酸代谢蛋白的调控。