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背景与目的胃癌（Gastric cancer,GC）是一种普遍但具有异质性的消化系统恶性肿瘤,其发生和发展是涉及多个基因和多个因素,复杂且循序渐进的病理过程。胃癌的治疗以手术治疗为主,但因绝大多数患者错失了最佳手术治疗时机,所以,只能以化学药物治疗为主要的治疗手段。然而,严重的细胞毒副作用以及多药耐药性（multidrug resistance,MDR）的形成使其疗效有一定的局限性。所以,如何提高化学药物治疗的靶向性和抗MDR特性是癌症靶向治疗的研究重点。根据GC的异质性以及本实验室前期关于黏着斑激酶（Focal adhesion kinase,FAK）在GC发生和发展中的研究结果,我们选择脱嘌呤/嘧啶核酸内切酶1（apurinic/apyrimidinic endodeoxyribonuclease 1,APE1/HAP1 APE/APEX 1）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）作为我们的研究对象。APEX1是碱基切除修复（Base Excision Repair,BER）途径中重要的DNA修复酶以及许多转录因子的氧化还原激活剂,其表达上调与DNA损伤性耐药性,肿瘤侵袭性以及不良预后等有关。VEGF作为促血管生成因子可诱导某些病理状况的发生和发展,包括肿瘤血管生成、转移形成以及肿瘤细胞的增殖等。这两个基因均可作为癌症诊断、预后以及治疗干预的潜在靶标。此外,作为细胞中基因表达的主要调节剂之一,小核糖核酸/微小RNA（microRNAs,miRNAs）介导的RNA干扰（RNA interference,RNAi）是一种有前途的抗癌治疗剂。然而,目前有关miRNAs通过调控其靶点基因,进而调节GC的发生、发展以及MDR形成的研究尚无文献报道。因此,我们通过在线数据库分析预测靶向APEX1的miRNAs,发现miR-27a-5p在GC的表达极低,而且通过靶向调控APEX1调节GC的发生和发展,具有抑制化疗药物MDR形成的潜力,可作为癌症治疗的工具。基于以上考虑,我们首先以规律成簇间隔回文重复/Cas9（n）[Cluster regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9（nick）,CRISPR/Cas9（n）]技术为基因编辑工具,在人胃癌细胞中分别敲除APEX1和VEGF,建立了双等位基因敲除的细胞模型,再以这些细胞模型对APEX1和VEGF在胃癌发生、发展过程中的作用及其与胃癌化疗时MDR形成的关系进行了初步探究。在此基础上,为了进一步探索APEX1在临床化疗过程中可能的潜在价值,我们以前期筛选出对胃癌细胞具有良好特异性和敏感性的胃癌靶向多肽（GP5）作为胃癌靶向导向元件,以靶向负调控APEX1且与胃癌的MDR形成关系密切的miR-27a-5p作为MDR抑制剂,制成胃癌靶向脂质体递药系统（GP5/Lipo/DOX/miR-27a-5p）,并检验了该药物体系的体外疗效,特别是结合APEX1基因敲除细胞模型的使用,初步揭示了APEX1/miR-27a-5轴在胃癌的发生、发展以及靶向治疗中的作用及其机制。本文丰富了胃癌的发生发展的分子细胞生物学理论,并为胃癌未来的靶向化疗药物的研发提供了新的思路和策略。方法1.以在线数据库（GEPIA、GTEx 以及 cBio Cancer Genomics Portal等）对APEX 1和VEGF的表达进行检索分析。2.以实时定量RT-PCR对APEX1基因在SGC-7901中的表达进行检测。3.以CRISPR/Cas9（n）基因编辑工具,在人胃癌细胞SGC-7901细胞中分别敲除APEX 1和VEGF基因,并用DNA测序以及western blot实验验证基因敲除结果。4.APEX1和VEGF基因敲除后:以CCK-8、克隆形成以及细胞倒置显微镜观察实验检测细胞增殖,以细胞划痕和Transwell小室实验检测细胞运动能力,以流式细胞仪检测细胞周期,以DAPI染色实验检测细胞凋亡,以考马斯亮蓝染色、细胞结晶紫染色、扫描电子显微镜观察、激光共聚焦显微镜观察以及细胞免疫组化等实验检测细胞运动相关骨架微结构,以半定量RT-PCR和western blot实验分别检测EMT形成、MDR形成以及细胞生存等相关蛋白的表达水平。5.以在线数据库（miRDB、miRTarBase、TargetScan、TarBase v.8、miRBase、VENNY 2.1、Kaplan Meier plotter 以及 ONCOMIR 等）预测靶向 APEX1 的最佳miRNA（miRNA-27a-5p）并获取 pre-miRNA-27a-5p 和 APEX1 3’UTR 序列信息,检测生存曲线以及Cox回归分析等。6.在HEK-293细胞中,以双荧光素酶报告基因实验验证APEX1和miRNA-27a-5P的靶向关系。7.以miR-27a-5p表达载体转染SGC-7901（WT）细胞或以miR-27a-5p抑制剂（Anti-miR-27a-5p）转染 A-/-（KO）细胞后:以实时定量 RT-PCR 验证 miR-27a-5p过表达,以CCK-8实验检测细胞增殖,以细胞划痕和Transwell小室实验检测细胞运动能力。8.利用薄膜超声分散法、硫酸铵pH梯度法（载DOX）以及阳离子脂质体的特性等制备脂质体载药体系（GP5/Lipo/DOX、GP5/Lipo/DOX/miR-27a-5p以及GP5/Lipo/DOX/Anti-miRNA）。9.以激光粒度仪、荧光分光光度计、SEM以及TEM等检测胃癌靶向脂质体载药体系的理化特性、DOX包封率以及形态,并优化GP5/Lipo/DOX和miR-27a-5p的细胞转染质量比,以细胞转染效率评估GP5/Lipo/DOX/miR-27a-5p的靶向性。10.以胃癌靶向载药体系转染细胞后:以CCK-8、克隆形成以及倒置显微镜观察细胞增殖,以细胞划痕和Transwell小室实验检测细胞运动能力,以流式细胞仪检测细胞凋亡,以细胞结晶紫染色、SEM观察以及激光共聚焦显微镜观察等实验检测细胞运动相关骨架微结构,以western blot实验检测EMT形成、MDR形成以及细胞生存等相关蛋白的表达水平。结果1.APEX1和VEGF基因在SGC-7901中的表达显著上调,均作为促癌基因发挥作用。2.基于CRISPR/Cas9（n）基因编辑技术,成功构建APEX1和VEGF基因敲除SFGC-7901 细胞系。3.敲除APEX1和VEGF基因可显著抑制胃癌细胞的增殖、迁移能力以及运动相关骨架微结构的发达程度。4.敲除APEX1和VEGF基因可导致胃癌细胞的周期阻滞,但不会明显促进细胞凋亡。5.敲除APEX1和VEGF基因可显著改变EMT和MDR相关蛋白的表达,提示APEX1和VEGF可调控胃癌细胞的EMT形成,而且可能调控胃癌细胞的对化疗药物的敏感性。6.敲除APEX1和VEGF基因可显著改变细胞生存相关蛋白的表达,由此推测,APEX1和VEGF可能通过MAPK和AKT途径的调控来调节胃癌的进程或对化疗药物的敏感性。7.双荧光素酶报告基因实验结果提示,miR-27a-5p通过靶向负调控APEX1而发挥其作用。8.miR-27a-5p的过表达显著抑制APEX1基因的表达,从而抑制胃癌细胞的增殖和迁移能力。而抑制内源性miR-27a-5p的表达（Anti-miRNA）可逆转APEX1敲除所导致的胃癌细胞增殖或迁移能力的减弱。9.胃癌靶向脂质体载药体系（GP5/Lipo/DOX 和 GP5/Lipo/DOX/miR-27a-5p）的理化特性、DOX包封率以及稳定性均符合后续细胞实验要求。10.胃癌靶向肽（GP5）引导的脂质体载药体系GP5/Lipo/DOX/miR-27a-5p或GP5/Lipo/DOX/Anti-miRNA 可有效地将 DOX 以及 miR-27a-5p 或 Anti-miR-27a-5p靶向递送至SGC-7901细胞。11.相对于胃癌WT细胞,APEX1敲除细胞（KO）对DOX处理更为敏感。12.DOX可显著抑制细胞的增殖能力、运动能力以及细胞运动相关的骨架微结构,显著抑制EMT相关蛋白、MDR相关蛋白以及细胞生存相关蛋白的表达,并显著促进SGC-7901细胞的凋亡。miR-27a-5p则促进DOX对胃癌细胞恶性表型的抑制。13.miR-27a-5p通过靶向负调控APEX1调节,与DOX协同抑制胃癌细胞的恶性表型,而抑制内源性miR-27a-5p的表达（Anti-miRNA）可显著逆转APEX1敲除和DOX所引起的胃癌细胞迁移能力的减弱以及细胞凋亡的增加。14.APEX 1/miR-27a-5p轴可能通过MAPK和AKT途径参与胃癌的各种信号通路。结论1.APEX1和VEGF基因在胃癌中的表达上调,均作为促癌基因发挥作用。利用CRISPR/Cas9（n）敲除APEX1和VEGF可抑制胃癌细胞的恶性表型。2.miR-27a-5p可通过对APEX1的靶向负调控来调节胃癌细胞的恶性表型,尤其是细胞的增殖能力和运动能力。Anti-miR-27a-5p（抑制内源性miR-27a-5p）可逆转APEX1敲除所导致的细胞的增殖能力和运动能力的减弱。3.胃癌靶向脂质体载药体系（GP5/Lipo/DOX、GP5/Lipo/DOX/miR-27a-5p以及GP5/Lipo/DOX/Anti-miRNA）具有明显的SGC-7901细胞靶向性,且可以有效递送DOX、miR-27a-5p 或 Anti-miRNA 至细胞。4.APEX1敲除（KO）细胞相较于WT细胞对DOX处理更为敏感,说明APEX1敲除导致胃癌细胞对DOX的敏感性有所升高。提示,APEX1可能参与胃癌细胞的MDR形成过程。5.DOX可显著抑制胃癌细胞的恶性表型,miR-27a-5则与DOX协同作用进而促进其作用。而Anti-miR-27a-5p（抑制内源性miR-27a-5p）则部分逆转APEX1敲除和DOX联合介导的细胞恶性表型的抑制。提示,miR-27a-5通过靶向负调控APEX1,与DOX协同抑制胃癌的发生和发展,并延迟耐药性的发展,具有联合抗癌作用。6.APEX1可能通过对细胞DNA损伤反应途径的调控来调节GC细胞对DOX的敏感性,而APEX1/miR-27a-5p轴可能通过MAPK和AKT途径参与调节胃癌发生、发展以及MDR形成相关的各种信号通路。