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研究背景及目的缺氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension,HPH)是由低氧引起的以持续肺动脉压力增高、肺血管结构改建,并伴有右心室肥大为特征的慢性进行性疾病,是肺源性心脏病、高原心脏病等发病的中心环节。研究表明,肺血管内皮损伤及功能紊乱可致肺血管收缩和血管结构重构[1,2],在HPH的发生发展中发挥重要作用。由于HPH的发病机制尚不完全清楚,迄今尚缺乏有效的预防及治疗措施。以往研究发现,在HPH的发生发展中炎症免疫反应发挥着重要作用。因此,减轻血管内皮细胞炎性损伤已经成为防治HPH的重要途径。白藜芦醇(Resveratrol,RSV)是广泛存在于葡萄、藜芦、虎杖等植物中的一种多酚类化合物,具有广泛而重要的生物学活性。研究表明,RSV是一种天然抗氧化剂,具有抗炎症、调节免疫、抗过敏、抗突变、降低血液黏稠度保持血液畅通、预防癌症的发生及发展等药理活性,被广泛应用于医药、保健品、化妆品和食品添加剂等领域。有研究发现,RSV可抑制缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡[3],其机制与RSV能够增加心肌组织内SIRT1的表达,进而抑制P53的促凋亡活性,最终抑制缺血再灌注后的心肌细胞凋亡有关[4]。RSV具有抗炎症反应效应,提示其可拮抗低氧引起的血管内皮细胞炎性损伤。但是,关于RSV能否对抗低氧引起的血管内皮细胞炎性损伤暂无报道。本课题采用人脐静脉内皮细胞(EA.hy926),1%O2低氧培养。探讨RSV对低氧内皮细胞的保护效应及机制,以进一步揭示HPH及其发病机制,为寻求关键有效的HPH防治靶点提供线索和实验依据。方法(1)EA.hy926细胞分为常氧组、低氧12 h组、低氧24 h组、低氧48 h组、低氧72h组。采用倒置显微镜观察低氧后细胞形态变化;CCK8法检测低氧后细胞活力的改变;q RT-PCR法检测低氧后SIRT1 m RNA表达变化;Western blot法检测低氧后SIRT1蛋白表达变化。(2)EA.hy926细胞分为常氧组、低氧组、低氧+DMSO、低氧+RSV(0.6μM、1.7μM、5μM、15μM、45μM剂量)组。CCK8法检测RSV给药后细胞活力的变化。(3)EA.hy926细胞分为常氧、低氧、低氧+DMSO、低氧+RSV(5μM、15μM、45μM剂量)组。q RT-PCR法检测SIRT1、IL-6和ICAM-1 m RNA;Western blot法SIRT1、PGC-1α和NF-κB p65蛋白的表达,流式细胞术检测活性氧(ROS)含量。结果1低氧对内皮细胞活力及SIRT1表达的影响1.1低氧对内皮细胞形态的影响低氧环境下,EA.hy926细胞由单层铺路石样多角形细胞变为长梭形,细胞排列疏松,细胞内颗粒状物质增多;随着低氧时间的延长,细胞数量逐渐减少,细胞内颗粒状物质增加明显,提示低氧对内皮细胞造成一定程度的损伤,并且随着时间延长,损伤作用显著增强。1.2低氧对内皮细胞活力的影响常氧状态下,内皮细胞培养24 h后进入对数增长期,细胞个数呈指数增加。低氧时,细胞增殖速度变慢,培养24 h后,细胞数量相对常氧减少一倍。培养48 h后,低氧组细胞数量开始减少,提示低氧环境可能对内皮细胞造成一定程度的损伤,进而导致细胞数量减少。1.3低氧对内皮细胞SIRT1表达的影响低氧时,内皮细胞内SIRT1 m RNA和蛋白表达显著下调,并且随着培养时间的延长,SIRT1 m RNA和蛋白表达下调趋势增加,差异有统计学意义(p<0.05)。2 RSV对低氧内皮细胞的保护效应低氧降低EA.hy926细胞活力并且抑制其增殖,不同浓度的RSV(0.6μM、1.7μM、5μM、15μM和45μM)给药后均可提高细胞活性,抑制细胞凋亡,15μM RSV对细胞的保护作用最明显。因此,选取5μM、15μM和45μM浓度的RSV作为实验浓度。与常氧组相比,低氧组IL-6和ICAM-1 m RNA表达显著增加,差异有统计学意义(p<0.05);与低氧组相比,不同浓度的RSV(5μM、15μM和45μM)给药后,IL-6和ICAM-1 m RNA表达均有不同程度的减少,差异有统计学意义(p<0.05)。与常氧组相比,低氧组ROS生成显著增加,差异有统计学意义(p<0.05);与低氧组相比,不同浓度的RSV(5μM、15μM和45μM)给药后,ROS生成逐渐减少,差异有统计学意义(p<0.05)。3 RSV保护低氧内皮细胞的机制研究与常氧组相比,低氧组SIRT1、PGC-1α蛋白表达下调,差异有统计学意义(p<0.05);磷酸化NF-κB p65蛋白表达上调,差异有统计学意义(p<0.05);与低氧组相比,RSV作用于细胞后,SIRT1、PGC-1α蛋白表达上调,差异有统计学意义(p<0.05);磷酸化NF-κB p65蛋白的表达下调,差异有统计学意义(p<0.05)。结论1低氧抑制内皮细胞活性,可能与抑制SIRT1表达,造成内皮细胞炎性损伤,细胞内ROS、IL-6、ICAM-1表达增多,进一步加重炎症反应有关。2不同浓度的RSV均可增强低氧内皮细胞的活性、抑制细胞凋亡,并且在一定浓度范围内具有剂量依赖性,其中15μM的RSV保护效应最明显。3RSV可以保护低氧内皮细胞,并增强细胞的活性。其生物学保护作用可能是通过激活SIRT1/PGC-1α信号转导通路并下调细胞内ROS表达水平,进而抑制细胞内的炎症反应而实现的。