水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一,杂交水稻的应用为粮食增产做出了巨大贡献。作为自花授粉作物,杂交水稻的成功得益于雄性不育的利用,包括细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility, CMS)和核雄性不育(genic male sterility, GMS)。光敏不育系农垦58S的发现开启了利用光温敏核雄性不育性培育两系法杂交水稻的序幕,迄今已育成100多个两系不育系,极大地推动了两系杂交水稻的应用。但是,对大多数不育系携带的不育基因及其相互关系并不十分清楚,在一定程度上妨碍了两系法杂交水稻的育种和生产应用。本研究首先选取在两系杂交水稻生产中广泛应用的温敏不育系株1S,利用图位克隆方法初步定位了株1S的温敏核不育基因,通过对大量两系不育系及可育品种的分析,确定了温敏不育的候选基因,开发了功能性的分子标记。随后对中国两系杂交水稻生产上曾经或正在广泛应用的光温敏不育系所携带的不育基因进行了鉴定,较全面了解了光温敏核不育基因在两系杂交稻中应用的历史与现状。最后利用亚细胞定位及RNAi技术对温敏核雄性不育基因的分子特征和功能进行了研究。主要结果如下：1、利用2个定位群体和SSR等分子标记将控制株1S的温敏雄性核不育基因定位在第2号染色体上,与RM12521和RM12721分别相距9.93cM和1.46cM。该区间包含了广占63S不育基因的候选位点,且等位性测定表明株1S和广占63S不育基因等位。据此,进一步推测株1S与广占63S一样在RNaseZ (RNZ)基因位点发生了突变。2、通过对14个光温敏不育系和21个野生型可育品种的RNZ测序发现,所有温敏不育材料均携带相同的RNZ突变,自翻译起始的第70-72个核苷酸为终止密码子TAG,定名为RNZm,而可育品种在该位点有2种基因型即TCG(RNZtc)和GCG(RNZgc)。进一步分析发现,携带RNZtc型与RNZm的品种除突变位点之外该基因其余序列完全一致,而RNZge型则在该基因的内含子处含有其它的变异,从而可进一步分为6种组型。3、针对RNZ不同等位基因开发了2个dCAPS标记,对32个光温敏不育系和310个正常可育品种的RNZ基因进行了鉴定。结果表明,RNZm突变只专一的存在于温敏不育系,而携带RNztc和RNZgc的均为野生型品种。通过测序和dCAPS标记验证的材料中,RNZgc类型均比RNZ°类型多。4、根据控制光敏不育的基因(LoC_Os12g36030)的C→G突变,开发了区分光敏(lncRm)和野生型品种(lncRw)的功能性CAPS标记。利用光敏CAPS标记和温敏的dCAPS标记对在生产上曾经或正在广泛应用的两系不育系携带的光温敏不育基因进行了鉴定。结果发现,安农S-1和株1S及其衍生不育系均携带温敏不育基因RNZm,而以农垦58S为唯一不育基因源的衍生不育系中,有携带lncRm或RNZm的,还有同时携带或同时不携带这两个基因的材料。5、根据光敏和温敏不育基因测序或标记鉴定结果,绘制了包含92个两系不育系的光温敏基因演变图。发现我国两系水稻不育系中不育基因的传递与品种系谱存在不一致现象,而育种过程中温敏基因的出现可能是造成光温敏特性变化的重要原因之一。同时,结合两系杂交稻分品种种植面积数据分析,揭示了1993-2012年间我国两系杂交稻中不育基因的利用经历了从光敏到温敏的演化过程,2012年温敏不育系配制的杂交稻已占两系杂交稻种植面积的95%以上。目前温敏不育基因已在两系杂交稻生产中占绝对主导地位。6、根据光敏和温敏不育基因与可育等位基因的序列差异,开发了可用于高通量分型的HRM标记。通过比较4种HRM分型方法,即复制子直接扫描、PCR前加15%WT或MT的DNA、非标记探针分型以及CADMA法,最终确定CADMA方法能很好地区分开两个基因位点的所有基因型,为分子标记辅助育种及种子纯度鉴定提供了一种简便高效的方法。7、通过构建RNZ基因与绿色荧光蛋白基因的融合表达载体并在水稻原生质体中瞬时表达,确定了该蛋白定位于叶绿体中。8、构建了RNZ基因的RNAi表达载体,通过农杆菌介导法获得T0代转基因材料,经叶片GUS染色、潮霉素抗性和GUS标记基因的PCR检测,确认2个转基因阳性株系。靶基因定量RT-PCR分析表明,阳性株系表达水平明显下降(35%-45%)。