血吸虫病是由血吸虫尾蚴感染引起的一种人畜共患寄生虫病,对宿主造成严重病理性损害,是WHO确定的六大重点热带病之一。由于血吸虫的多阶段发育生活史比较复杂,虫体诱发宿主的免疫应答机制以及逃避机制不甚清晰,使获得良好保护效果的血吸虫病疫苗研究被制约。因此,寻找更有效的疫苗候选分子也许成为防控血吸虫病的一种重要途径。跨膜蛋白位于生物膜两端,贯穿细胞与外界之间,具有介导信号转导、分子运输、能量转换等多种重要的功能。位于血吸虫体被的跨膜蛋白,直接与宿主的免疫系统相接触,因此,体被跨膜蛋白可能为宿主与虫体信息交流的重要分子。开展跨膜蛋白的功能研究对日本血吸虫疫苗的开发也很有必要。本论文对跨膜蛋白TMEM66P在血吸虫寄生和生殖发育中的功能进行初步探索,主要包括以下三个方面的研究:(一)日本血吸虫TMEM66P基因编码cDNA的克隆表达及生物信息学分析根据日本血吸虫TMEM66P序列设计引物,进行PCR扩增出该序列的cDNA片段,序列分析表明扩增的该cDNA片段包括1008 bp的开放阅读框,编码蛋白预测分子量为37.93 kD。生物信息学分析表明TMEM66P存在跨膜区,TMEM66P序列与曼氏血吸虫同源性为67.79%,与小鼠同源性为44.54%。另外,本研究中成功构建了原核重组蛋白pET32a(+)-TMEM66P,并成功表达纯化。(二)TMEM66P在日本血吸虫不同发育时期和性别中的转录分析通过RT-PCR方法检测TMEM66P在日本血吸虫的不同发育时期及性别中的转录水平。结果显示TMEM66P基因在日本血吸虫不同发育时期均有表达,在日本血吸虫虫卵及感染小鼠的35 d虫体的表达量显著高于14 d、21 d,在感染的28 d虫体的表达量次之。此外,在感染小鼠的28 d虫体中,TMEM66P在雄虫中表达量高于雌虫,在感染的35 d虫体中,TMEM66P在雄虫中的表达显著高于雌虫。上述结果表明TMEM66P在不同发育时期及不同性别中具有表达差异性,提示该基因可能在日本血吸虫的生殖产卵和生长发育中起重要作用。(三)日本血吸虫TMEM66P的功能初步研究利用RNAi技术对日本血吸虫TMEM66P基因进行体外干扰实验,筛选出干扰效果最佳的小RNA分子(siRNA-664)。利用RT-PCR对干扰后虫体卵壳蛋白基因进行检测,发现卵壳蛋白基因AY222895.1,AY814244.1,M59318.1和D32205.1基因表达水平显著降低。利用CellTiter-Lumi?法检测干扰血吸虫后的虫体细胞活性,虫体细胞活力显著下降;对干扰后虫体产卵量进行统计分析,发现干扰后虫体产卵量显著降低;随着干扰时间延长,虫体活力逐渐降低。表明TMEM66P表达水平的下降对雌虫产卵及虫体活性均有影响,提示TMEM66P可能在日本血吸虫生殖发育中发挥重要调控作用。