DDT(Dichlorodiphenyltrichloroethane)，即1，1-(2，2，2-三氯乙叉)-双(4-氯苯)，中文名称滴滴涕，是一种在环境中持续性存在的有机污染物，是第一个被广泛使用的合成有机氯农药。它的出现给十亿人摆脱疟疾带来了福音，它的发明者M(u|¨)ller曾在1944年获得了诺贝尔医学奖。但是，它的蓄积性，长范围的迁移性，在环境中的不易降解性和内分泌干扰作用给人们带来了更多的困扰。尽管在欧美国家上世纪70年代开始，DDT就被限制使用，但是痕量DDT可在几乎所有的人群和偏远的地区中被检测到。有报道，如果一个个体不再暴露于DDT中，它的消失大概要花10-20年，但是DDT的代谢产物DDE可以终生存在。因此，DDT被列为12个持续性有机污染物(persistent organic pollutants，POPs)之一。P，P’-DDE是DDT的最主要的代谢产物，有较高的蓄积性，因而在人体组织中的浓度也很高。它也是一种已知的环境内分泌干扰物之一，可以通过直接的毒作用和干扰生物体内正常的内分泌功能对男性生殖系统产生不良影响。很多最近的研究表明，DDT和它的代谢产物可以诱导组织或细胞发生凋亡，但是关于它们对男性生殖系统作用的报道较少。本研究的目的就是从体内和体外两个方面探讨P，P’-DDE对睾丸细胞凋亡的影响。鉴于P，P’-DDE具有脂质过氧化作用并损伤线粒体的功能，以及线粒体在细胞凋亡中的重要作用，我们还研究了线粒体及其相关蛋白在p，p’-DDE诱导细胞凋亡中的作用。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是指可以从细胞膜转导至细胞核的酪氨酸/丝氨酸激酶，在细胞增殖、存活、分化和凋亡中起着重要的作用。很多有机氯农药已被证明具有诱导MAPK磷酸化的作用，但是对P，P’-DDE的研究较少，尤其缺乏它在男性生殖系统的研究。我们以前的研究发现P，P’-DDE可以诱导支持细胞ERK磷酸化作用。在本研究中，我们探讨了MAPK另外两个与细胞凋亡相关的通路P38和JNK的磷酸化作用在P，P’-DDE诱导支持细胞凋亡中的作用。本研究的目的就是从体内和体外两个方面探讨P，P’-DDE对睾丸细胞的氧化应激、线粒体凋亡通路和MAPK信号转导通路的影响，并观察它对睾丸细胞凋亡的影响，进而揭示MAPK、线粒体凋亡通路、氧化应激与细胞凋亡之间的关系。第一部分P，P’-DDE诱导睾丸支持细胞凋亡机制的研究一、抗氧化剂NAC对P，P’-DDE抑制大鼠睾丸支持细胞活力的拮抗作用目的：探讨P，P’-DDE对支持细胞活力的影响。方法：对离体培养的支持细胞分别用不同终浓度的10、30、50、70μmol/LP，P’-DDE染毒24h，以及300μmol/L NAC预处理1h后再染毒50μmol/L P，P’-DDE，用MTT比色法测其在490nm的吸光度值。结果：P，P’-DDE达到30μmol/L时，与溶剂对照组比，吸光度值显著下降，差异有统计学意义(P＜0．05)；P，P’-DDE达到50μmol/L时，细胞存活率达到70％，300μmol/LNAC预处理可以显著增加细胞存活率。结论：P，P’-DDE可以抑制支持细胞存活力，NAC预处理可以拮抗P，P’-DDE的细胞毒作用。二、P，P’-DDE对支持细胞总SOD活力、MDA含量、ROS、线粒体膜势能的影响，及NAC的拮抗作用目的：检测P，P’-DDE染毒后支持细胞总SOD活力、MDA含量、ROS、线粒体膜势能的影响。方法：用SOD和MDA试剂盒测定不同终浓度的P，P’-DDE(10、30、50μmol/L)染毒24h后，支持细胞内的总SOD活力和MDA含量。用流式细胞仪测定支持细胞内ROS和线粒体膜势能。结果：所有剂量的P，P’-DDE可减小支持细胞总SOD活力，30、50μMP，P’-DDE增强MDA含量，差异均有统计学意义(P＜0．05)。所有剂量的P，P’-DDE可减少支持细胞线粒体膜势能，50μmol/L的P，P’-DDE可显著增加支持细胞内ROS的含量，300μmol/L NAC可以显著抑制线粒体膜势能的降低和ROS的增高，差异均有统计学意义(P＜0．05)。结论：P，P’-DDE可以诱导氧化应激引起的线粒体功能破坏。三、P，P’-DDE对支持细胞线粒体相关基因细胞色素c、Bax、Bak、Bcl-w表达的影响及NAC的作用目的：检测P，P’-DDE对支持细胞细胞线粒体相关基因细胞色素c、Bax、Bak、Bcl-W表达的影响及NAC的作用。方法：采用实时荧光定量PCR测定支持细胞中细胞色素c、Bax、Bak、Bcl-w mRNA的表达水平。采用Western blotting测定支持细胞中Bax、Bak、Bcl-w和胞浆中细胞色素c表达水平。结果：30、50μmol/L的P，P’-DDE可显著增加支持细胞内细胞色素c、Bax、Bak mRNA表达水平，Bcl-w mRNA表达水平变化不明显，RNA合成酶抑制剂放线菌素D可以拮抗细胞细胞色素c、Bax、Bak mRNA的改变。30、50μmol/L的P，P’-DDE可显著增加支持细胞内Bax、Bak、胞浆内细胞色素c蛋白表达水平，50μmol/L的P，P’-DDE可显著降低支持细胞内Bcl-w蛋白表达水平，NAC可以拮抗细胞色素c、Bcl-w的改变。结论：P，P’-DDE可以影响基因转录和通过氧化应激途径影响支持细胞线粒体基因的表达。四、P，P’-DDE对支持细胞p38和JNK磷酸化表达水平的影响及NAC的作用目的：P，P’-DDE对支持细胞p38和JNK磷酸化表达水平的影响及NAC的作用。方法：采用Western blotting测定支持细胞中p38和JNK蛋白磷酸化表达水平的影响。结果：30、50μmol/Lp，P’-DDE可显著增加支持细胞p38的磷酸化，所有剂量的P，P’-DDE可显著增加支持细胞JNK的磷酸化，NAC可以拮抗p38和JNK的磷酸化改变。结论：P，P’-DDE可以诱导氧化应激引起的MAPK磷酸化。五、氧化应激、MAPK信号转导、基因转录在P，P’-DDE诱导支持细胞凋亡中的作用目的：P，P’-DDE对支持细胞凋亡的影响及其与氧化应激、MAPK磷酸化、基因转录的关系。方法：对离体培养的支持细胞分别用10、30、50μmol/L P，P’-DDE染毒24h，以及300μmol/L NAC、1 nM放线菌素D、10μmol/L SB203580及SP600125预处理1h后再染毒50μmol/L P，P’-DDE，采用Hoechst和流式细胞仪的技术，测定P，p’-DDE对支持细胞凋亡的影响。结果：30、50μmol/L的P，P’-DDE可引起细胞核碎裂、片段化，显著诱导支持细胞凋亡，抗氧化剂NAC、p38抑制剂SB203580、RNA合成酶抑制剂放线菌素D可以拮抗P，P’-DDE引起的凋亡，而JNK抑制剂SP600125没有显著影响。结论：P，P’-DDE可以通过氧化应激、p38和基因转录诱导支持细胞凋亡。第二部分P，P’-DDE对断乳期SD大鼠睾丸细胞凋亡的影响一、P，P’-DDE对断乳期SD大鼠脏器系数的比较和常规的HE染色结果目的：不同浓度P，P’-DDE腹腔注射后大鼠脏器系数的比较和常规的HE染色结果。方法：用不同浓度的P，P’-DDE(0、20、100mg/kg)及阳性对照氟他胺(40mg/kg)隔天对断乳期大鼠染毒10天后，处死动物，称重脏器，HE染色观察大鼠睾丸组织形态学改变。结果：100mg/kg P，P’-DDE处理组肝脏的脏器系数和对照组相比有差异有显著性；40mg/kg氟他胺处理组前列腺、睾丸脏器系数和对照组相比有差异有显著性。HE染色结果显示对照组睾丸曲细精管及其间质结构正常、完整，支持细胞及各级生精细胞排列规则，形态正常。经DDE处理后，生精细胞排列紊乱、发生脱落，数目及层次明显减少。结论：P，P’-DDE可以引起睾丸组织发生病理学改变。二、P，P’-DDE对大鼠睾丸细胞凋亡的影响目的：检测P，P’-DDE对大鼠睾丸细胞凋亡的影响。方法：用TUNEL免疫组织化学的方法检测P，P’-DDE对大鼠睾丸细胞凋亡的影响。结果：20、100mg/kg P，P’-DDE均可以诱导睾丸细胞凋亡，以精原细胞和精母为主，伴有支持细胞。结论：P，P’-DDE可以诱导大鼠睾丸细胞凋亡。三、P，P’-DDE对大鼠睾丸组织总SOD活力、MDA含量和GSH-Px活性的影响目的：P，P’-DDE对大鼠睾丸组织总SOD活力、MDA含量和GSH-Px活性的影响。方法：用SOD、MDA和GSH-Px试剂盒测定睾丸组织总SOD活力、MDA含量和GSH-Px活性。结果：20、100mg/kg P，P’-DDE及40mg/kg氟他胺均诱导睾丸组织SOD活力下降，100mg/kg P，P’-DDE可以诱导睾丸组织MDA含量升高、GSH-Px活力下降。结论：P，P’-DDE可以诱导氧化应激，引起脂质过氧化。四、P，P’-DDE对大鼠睾丸组织Bax、Bak、Bcl-w表达的影响目的：P，P’-DDE对大鼠睾丸组织Bax、Bak、Bcl-w mRNA表达的影响。方法：采用实时荧光定量PCR测定睾丸组织中Bax、Bak、Bcl-w在mRNA上的表达水平；采用Western blotting测定睾丸组织中Bax、Bak、Bcl-w在蛋白上的表达水平。结果：40mg/kg氟他胺、100mg/kg P，P’-DDE可以诱导睾丸组织Bax、Bak在RNA和蛋白水平表达升高，但对Bcl-w影响不明显。结论：P，P’-DDE可以影响Bax家族中抗凋亡和诱凋亡基因和蛋白表达水平。本研究的创新点有：①首次发现了P，P’-DDE可以通过激活线粒体介导的细胞凋亡通路诱导睾丸细胞发生凋亡②发现了P，P’-DDE可以通过氧化应激诱导睾丸细胞p38和JNK磷酸化，但仅仅p38凋亡通路起重要作用