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研究背景糖尿病患病群体的心血管并发症是导致其患病率和死亡率增加的主要原因。糖尿病患病群体发生动脉粥样硬化性病变的时间更早,预后更差。与无糖尿病的冠心病患者相比,伴发糖尿病的冠心病患者,其冠脉病变表现更加复杂,易损斑块发生率更高。稳定易损斑块对于降低糖尿病患者心血管事件的发生率至关重要。动脉粥样硬化性疾病的进展过程与多种细胞的凋亡有关。其中,研究表明,VSMCs凋亡可能是斑块破裂进而导致心血管病变的中心事件。此外,研究也表明,DM患者冠状动脉血管病变也与平滑肌细胞凋亡有关。动脉粥样硬化斑块纤维帽主要由平滑肌细胞构成,平滑肌细胞的凋亡导致平滑肌细胞减少是易损斑块破裂的主要原因。因此探究VSMCs凋亡的机制可以为防治糖尿病心血管并发症疾病奠定理论基础。ALK7,是TGF-β家族Ⅰ型受体的成员。ALK7可以通过与Smad2/3结合并通过使其磷酸化的方式调控细胞。ALK7在人体各种细胞中广泛表达,并且在调节细胞的生长、分化以及凋亡中起到了重要作用。本课题组前期研究发现,ALK7在糖尿病心肌病中发挥了促进心肌细胞凋亡的作用以及促进心肌成纤维细胞转化和胶原合成的作用。然而,ALK7在糖尿病动脉粥样硬化中的作用目前还没有研究。综上所述,我们提出了如下假说:ALK7基因沉默可以改善2型糖尿病ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化易损斑块稳定性。在本实验中,我们建立了 2型糖尿病动脉粥样硬化模型,通过ALK7-ShRNA来抑制ALK7的表达观察ALK7在2型糖尿病动脉粥样硬化易损斑块中的作用,并通过体外实验探讨了 ALK7影响平滑肌细胞凋亡的作用机制。实验结果在动物、细胞和分子层面证明了 ALK7基因沉默通过减轻血管平滑肌细胞的凋亡进而改善2型糖尿病ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化易损斑块的稳定性,为预防以及治疗糖尿病动脉粥样硬化易损斑块带来了崭新的思路。研究目的1.研究ALK7对2型糖尿病ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块易损性的作用。2.探讨ALK7在血管平滑肌细胞凋亡过程中的作用及具体分子机制,为提高动脉粥样硬化斑块稳定性提供新的治疗靶点。研究方法(一)动物实验1.建立2型糖尿病动脉粥样硬化的ApoE-/-小鼠模型4周龄ApoE-/-小鼠用于实验,在其禁食12 h后,进行IPGTT实验,将小鼠随机分成两组:普通饮食组,高脂饮食组。普通饮食组喂养普通饮食,即正常饲料,高脂饮食组给予高脂饲料。喂养8周后,12周龄的ApoE-/-小鼠再次进行IPGTT实验,其中,高脂饮食组中出现胰岛素抵抗的小鼠接受腹腔注射小剂量STZ(80 mg/kg)一次,轻微破坏胰岛。两组小鼠以原饲料继续喂养2周,然后14周龄的ApoE-/-小鼠再次进行IPGTT实验,将那些出现胰岛素抵抗且血糖稳定升高的小鼠作为患有2型糖尿病的小鼠,成功纳入糖尿病组。2.IPGTT 试验将ApoE-/-小鼠禁食10 h-12 h,然后按照每只小鼠2 g/kg的剂量经腹腔注射葡萄糖,分别于0 min、15 min、30 min、60 min和120 min取尾静脉血测血糖;并计算血糖曲线下面积。3.体重监测ApoE-/-小鼠于4,12,14,22,24周龄称量体重。4.血生化指标检测实验末通过心尖取血的方法,分离血清检测血脂和空腹血糖。5.ApoE-/-小鼠尾静脉注射ALK7干扰慢病毒将ApoE-/-小鼠分为四组:普通饮食组(Chow组),糖尿病组(DM组),糖尿病+空载体组(DM+Nc-ShRNA组),糖尿病+ALK7干扰慢病毒组(DM+ALK7-ShRNA组)。对DM+Nc-ShRNA组小鼠的尾静脉注射慢病毒空载体,对DM+ALK7-ShRNA组小鼠尾静脉注射ALK7干扰慢病毒。构建ALK7基因沉默小鼠模型;通过western blot检测ALK7干扰效率。6.病理学检测主动脉血管行大体油红O染色,以观察主动脉脂质沉积;主动脉根部组织分别行HE染色,天狼猩红染色,油红O染色和免疫组化染色,分别检测主动脉根部组织斑块面积,胶原含量,脂质含量,平滑肌细胞含量(α-SMA),巨噬细胞含量(MOMA-2),然后计算斑块的易损指数。7.WB检测WB检测主动脉中ALK7的表达。(二)细胞实验1.小鼠主动脉平滑肌细胞(VSMCs)的分离提取及培养通过组织贴块法提取小鼠主动脉血管平滑肌细胞;细胞培养在温度为37℃,气体含量为95%O2和5%CO2的湿润细胞培养箱;培养液是含有10%的FBS和1%双联抗生素的低糖DMEM培养液。2.ALK7干扰慢病毒的转染当细胞密度约为40%～60%时,转染慢病毒,吸去培养瓶中原有培养基,加入1/2体积的新鲜培养基(1mL),并加入polybrene及病毒原液转染4h;4h后,取出培养瓶,在其中直接加入另外1/2体积的新鲜培养基;转染大约12-16 h后,换上新鲜的普通完全培养基;转染72 h后,通过观察细胞绿色荧光的表达来检测病毒的转染效率;并使用western blot检测ALK7干扰的效率。3.体外模拟糖尿病环境3.1高糖联合棕榈酸刺激VSMCs凋亡的时间的测定:25 mM高糖(HG)联合 400 μM 棕榈酸(PA)刺激 VSMCs 0 h,6 h,12 h,24 h,48 h,通过 western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2,Bax,Cleaved Caspase-3的蛋白表达水平以及目的分子ALK7的蛋白表达水平;3.2低糖(Ctrl),高渗+棕榈酸溶剂对照(Vehicle),高糖+棕榈酸(HG+PA)刺激VSMCs,进一步检测凋亡相关蛋白Bcl-2,Bax,Cleaved Caspase-3的蛋白表达水平以及目的分子ALK7的蛋白表达水平;3.3低糖(Ctrl),高糖+棕榈酸(HG+PA),高糖+棕榈酸+慢病毒空载体(HG+PA+Nc-ShRNA),高糖+棕榈酸+ALK7-ShRNA(HG+PA+ALK7-ShRNA)刺激VSMCs,通过western blot检测ALK7进一步检测凋亡相关蛋白Bcl-2,Bax,Cleaved Caspase-3,Bcl-2的蛋白表达水平以及目的分子ALK7的蛋白表达水平;以及Smad2/3,磷酸化Smad2/3的蛋白表达水平。研究结果1.在2型糖尿病ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块中ALK7蛋白的表达增加WB结果以及免疫组织化学染色结果显示,DM组ApoE-/-小鼠主动脉中ALK7的表达量明显高于Chow组增加(P<0.05)。2.ALK7基因沉默后2型糖尿病ApoE-/-小鼠主动脉ALK7蛋白表达下调尾静脉注射ALK7干扰慢病毒抑制ALK7的表达,WB结果显示,与DM组相比,DM+ALK7-ShRNA组ApoE-/-小鼠主动脉中ALK7表达量显著降低(P<0.05)。3.ALK7基因沉默改善2型糖尿病ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化易损斑块的稳定性(1)DM组与Chow组相比,其主动脉斑块负荷明显增加(P<0.05);DM+ALK7-ShRNA组与DM+Nc-ShRNA组相比,其主动脉斑块负荷明显降低(P<0.05);(2)DM组与Chow组相比,其主动脉根部斑块面积、脂质、巨噬细胞和易损指数明显增加(P<0.05);DM+ALK7-ShRNA组与DM+Nc-ShRNA组相比,其主动脉根部斑块面积、脂质、巨噬细胞和易损指数明显降低(P<0.05);(3)DM组与Chow组相比,其主动脉根部斑块平滑肌细胞和纤维化程度明显降低(P<0.05);与 DM+Nc-ShRNA 组相比,DM+ALK7-ShRNA 组 ApoE--/-小鼠主动脉根部斑块平滑肌细胞和纤维化明显增加(P<0.05)。4.高糖联合棕榈酸(HG+PA)刺激使VSMCs凋亡增加,ALK7蛋白表达增加。5.抑制ALK7的表达可以显著减少高糖联合棕榈酸刺激诱导的VSMCs凋亡。6.ALK7通过Smad2/3信号通路参与高糖联合棕榈酸诱导的VSMCs的凋亡。研究结论1.ALK7基因沉默改善2型糖尿病ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块稳定性;2.ALK7通过Smad2/3信号通路调节VSMCs的凋亡。