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前言 急性一氧化碳（CO）中毒以急性缺氧性脑损害的表现为多见，关于其致脑损伤机制，目前已受到广泛关注。研究发现急性CO中毒后神经元死亡包括凋亡和坏死。目前，生物学家已经认识到细胞凋亡的调节同细胞增生调节一样复杂，细胞凋亡需要启动相关的基因，已知癌基因bcl-2和抑癌基因p53是重要的凋亡调节基因，它们的蛋白表达产物bcl-2和P53分别具有抑制凋亡和促进凋亡的作用，本研究采用流式细胞术，检测急性CO中毒后大鼠大脑皮质bcl-2和P53蛋白的表达，以期进一步探讨CO中毒致脑损伤的机制。 材料与方法 1．实验动物与分组：健康Wistar大鼠25只，雌雄不拘，体重为180～220克，随机均衡均衡分成5组，分别为正常对照组、CO中毒即刻组，CO中毒后1小时、24小时、72小时组。 2．实验试剂和器材：CO气，bcl-2小鼠IgG单抗，p53兔IgG多抗，FITC标记山羊抗小鼠IgG，FITC标记山羊抗兔IgG和其它国产试剂。流式细胞仪，恒温离心机，血气分析仪，光学显微镜，CO快速检测管（A型）和O2检测管（B型）。 3．CO中毒模型建立：自制5L密闭染毒瓶，染毒时将大鼠置于染毒瓶内，通入CO气，使瓶内CO浓度保持在2000～3000ppm，O2浓度接近于空气中O2浓度。染毒时间为1小时，染毒过程中，每20分钟检测一次瓶内CO和O2浓度，使其维持恒定。 4．标本采集：所有染毒大鼠在染毒后即刻采血（球后静脉丛采血），测定COHb浓度，均在45%一60%之间;各组大鼠在规定时间点行腹腔麻醉，断头取脑，分离出大脑皮质，用网搓法制备单细胞悬液，经含1%多聚甲醛的PBS固定后，将细胞重新悬浮于染色应用液中保存。 5.染色:将细胞悬液离心弃上清，分别加人10闪bcl一2小鼠I步单抗和户3兔I步多抗（1:10，对照管不加此抗体），室温孵育30而n，用染色应用液离心洗涤2次后分别加人20闪羊抗小鼠I步一FrrC和羊抗兔I步一nTC（l:50），o一4℃避光孵育30而n，pBS洗2次，置O一4℃避光保存，待测。 6.上机检测:经氢离子激光激发，有bcl一2或户3蛋白表达的细胞就会发出荧光，表达的高低表现为荧光强度的强弱，计算机绘制细胞数一荧光强度图，以阳性管的平均荧光强度减去对照管本底，既为代表bcl一2和苗3表达量的平均荧光强度。 7.统计学分析:结果采用均数土标准差（又土s）表示，对bcl一2和P53表达量进行方差分析和组间两两比较分析，并对二者的表达量进行相关分析。实验结果 1.大脑皮质bcl一2蛋白表达量的变化:急性CO中毒后即刻bcl一2表达明显增加，中毒后1小时达高峰，与其它4组相比有显著差异（P<0.01），24小时后逐渐下降，而中毒后72小时bcl一2的表达水平仍高于对照组水平。 2.大脑皮质卢3蛋白表达量的变化:急性CO中毒后即刻P53表达有所增加，中毒后l小时达高峰，与其它4组相比有显著差异（P<0.01），24小时后逐渐下降，至72小时恢复正常。 3.急性CO中毒大鼠大脑皮质bcl一2和p53蛋白表达量之间存在时间相关性（r二0.92，P<0.05）。讨论 凋亡在多种生理和病理过程中起重要作用，而且不同的刺激均可引起凋亡的发生。近年来，大量调节凋亡的基因已被发现并受到广泛研究，实验表明bcl一2与户3在调控细胞凋亡时的作用相反。本实验测定急性Co中毒大鼠大脑皮质内玩1一2和户3蛋白的表达，探讨其在CO中毒时的表达特点及作用。 1.bcl一2在急性CO中毒大鼠大脑皮质中的表达:已知bcl一2基因家族编码的蛋白在凋亡调节中发挥着重要作用，其中bcl一2蛋白在发育中的神经系统表达丰富，成年后仅有低水平的表达;而当脑缺血发生时，bcl一2蛋白表达增加。本实验观察到染毒后即刻bcl一2表达明显增加，染毒后1小时达高峰，染毒后72小时仍有低水平增加，并未降到染毒前水平。其原因可能为:bcl一2作为一种抗凋亡蛋白，在受到损伤性刺激后明显增加，迅速达到高峰，并在对抗损伤性刺激过程中逐渐消耗;同时不能除外仍有少量bcl一2蛋白继续合成，以起到持续抑制细胞凋亡的作用，保护神经细胞免受进一步的损伤，这也许是机体对抗损伤性刺激的一种防御手段。目前有关bd一2抗凋亡机制的推测包括:bd一2能对抗由ROS生成剂带来的凋亡;参与调节凋亡时细胞浆和核内CaZ+的浓度;通过与bax结合形成异源二聚体，阻止bax插人线粒体外膜。 2.p53在急性CO中毒大鼠大脑皮质中的表达:野生型p53是受到最广泛研究的抑癌基因。本实验观察到染毒后即刻大脑皮质卢3蛋白表达有所增加，染毒后1小时达峰值，72小时后恢复到正常水平。一般认为p53在细胞凋亡的早期环节发挥作用，本研究也证实了这一观点，在神经元受损时，p53迅速作出应答，并诱导逐级链锁反应。研究显示户3诱导神经元死亡涉及到bax依赖性caspase3的激活和直接上调Apafl的转录。 本研究把急性CO中毒后各相同时间点大脑皮质bcl一2表达量与户3表达量进行比较，发现它们在Co中毒大脑皮质中的表达均有先增加后降低的趋势，存在时间相关性。根据目前研究，bcl一2和户3在抑制和促进凋亡发生机理上均有bax和caspas“3