研究背景与目的肿瘤耐药是导致肿瘤治疗失败的主要原因,极大限制了癌症药物的选择和使用。癌症耐药性研究至关重要,探索癌症耐药的机制和对抗耐药的新方法迫在眉睫。阿霉素(adriamycin,Adr)是一种可促进细胞内 ROS(reactive oxygen species)产生的抗肿瘤抗生素,同时也可抑制RNA(ribonucleic acid)和DNA(deoxyribonucleic acid)的合成,对多种肿瘤均有作用,但肿瘤多药耐药性的产生大大降低了阿霉素的治疗益处。Sambutoxin是4-羟基-2-吡啶酮类的衍生物,对人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞具有显著的抗增殖作用,是一种新型具有抗乳腺癌作用的候选化合物。前期研究表明:sambutoxin可诱导乳腺癌细胞产生ROS,从而引起细胞DNA损伤;降低线粒体跨膜电位,增加Bax/Bcl-2比率,增加线粒体细胞色素c释放,诱导细胞凋亡。ROS被证明与肿瘤抗药性的产生有关,大多数耐药细胞表现为抗氧化能力增强,抵抗ROS导致的促进细胞死亡作用。然而,sambutoxin是否可通过产生ROS来逆转阿霉素耐药乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性尚未有文献报道。本课题旨在研究sambutoxin增强耐阿霉素乳腺癌细胞MCF-7/ADR和K562/ADR对阿霉素敏感性的作用,并阐明其潜在的分子机制。实验方法和结果实验方法:1.检测 sambutoxin 和阿霉素对 K562、MCF-7、K562/ADR 和 MCF-7/ADR细胞的增殖抑制活性。首先采用MTT法依次检测阿霉素对K562、K562/ADR、MCF-7和MCF-7/ADR细胞增殖的抑制作用。计算阿霉素对耐药细胞和敏感细胞IC50的比值,确定K562/ADR和MCF-7/ADR两种细胞对阿霉素的耐药性。接着,通过MTT 法检测 sambutoxin 对 K562、K562/ADR、MCF-7 和 MCF-7/ADR 的细胞毒性作用,确定sambutoxin单用对耐药细胞的抑制作用以及与阿霉素合用的剂量。再通过MTT和CCK-8两种实验方法检测sambutoxin和Adr联合使用对K562、MCF-7、K562/ADR和MCF-7/ADR细胞的毒性作用。2.检测K562/ADR和MCF-7/ADR细胞中ROS水平的变化。采用DCFH-DA荧光探针法,使用荧光显微镜观察sambutoxin和Adr对K562/ADR和MCF-7/ADR细胞中ROS水平的影响;使用流式细胞术定量检测sambutoxin 和 Adr 对 K562/ADR 和 MCF-7/ADR 细胞中 ROS 水平的变化。3.检测sambutoxin和Adr合用对K562/ADR和MCF-7/ADR细胞凋亡的影响。采用Hoechst 33342染色法观察细胞凋亡的形态学变化。采用AnnexinV-FITC单染法定量细胞凋亡率。此外,通过蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白的表达。引入ROS清除剂NAC(N-acetyl-L-cysteine),观察细胞内ROS水平是否参与sambutoxin对细胞凋亡的影响。4.检测 sambutoxin 和 Adr 合用对 K562/ADR 和 MCF-7/ADR 细胞中PI3K/AKT/mTOR和EGFR/ERK信号通路的影响。通过蛋白质印迹法检测K562/ADR和MCF-7/ADR细胞中两个信号通路相关蛋白的表达水平。5.探讨sambutoxin增强K562/ADR和MCF-7/ADR细胞对Adr敏感性的机制。采用流式细胞术检测sambutoxin对K562/ADR和MCF-7/ADR细胞中Adr积累的影响。将K562/ADR和MCF-7/ADR细胞用或不用sambutoxin预处理24 hr后,加入10 μM的Adr孵育2-3 hr,处理后上机检测。同样方法检测两种细胞内Rh123 的蓄积。通过 Western blotting 印迹法测定 sambutoxin 对 K562/ADR 和MCF-7/ADR 细胞中 P-gp、MRP1、GSTπ、TopoⅡα、AKT 和 NF-κB 蛋白表达的影响。另外,使用Sybyl 2.0软件进行对接研究预测人P-gp与sambutoxin或Adr的3D相互作用,以维拉帕米(verapamil,VER)作为对照。引入ROS清除剂NAC,观察细胞内ROS水平是否参与sambutoxin对细胞内P-gp表达的影响。实验结果:1.Sambutoxin 增强 Adr 对 K562/ADR和MCF-7/ADR 细胞的敏感性MTT法的检测结果表明,K562/ADR和MCF-7/ADR细胞的耐药倍数分别为145.5和36.8,可用作研究逆转耐药的细胞模型。Sambutoxin的浓度在20 μM以下时单用对K562/ADR和MCF-7/ADR细胞几乎无毒性作用。MTT法和CCK-8法的结果都表明sambutoxin剂量依赖性地增强耐阿霉素K562/ADR细胞和MCF-7/ADR细胞对Adr的敏感性,对K562/ADR细胞作用更明显。但并没有增加阿霉素敏感K562和MCF-7细胞对Adr的敏感性。2.Sambutoxin和Adr可上调耐药细胞中的ROS水平荧光染色法和流式细胞仪检测结果表明两药合用可升高K562/ADR和MCF-7/ADR细胞内的ROS水平。3.Sambutoxin和Adr合用诱导K562/ADR和MCF-7/ADR细胞凋亡及其相关机制Hoechst 33342染色法和AnnexinV-FITC单染法检测结果发现,Adr与sambutoxin联合应用会明显增加Adr诱导的K562/ADR和MCF-7/ADR细胞凋亡数目。Western blotting检测结果表明二者合用可下调抗凋亡蛋白Bcl-2,上调促凋亡蛋白Bax,促进Caspase 3和PARP的裂解,通过线粒体途径诱导耐药细胞凋亡。并且,加入ROS清除剂NAC后,sambutoxin和Adr合用诱导的细胞凋亡数目明显减少。4.Sambutoxin 和 Adr 合用可下调 K562/ADR 细胞中 PI3K/AKT/mTOR 和EGFR/ERK信号通路以及下调MCF-7/ADR细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路Sambutoxin 与 Adr 合用可显著下调 K562/ADR 细胞中 PI3K、AKT、P-mTOR、P-EGFR和P-ERK的蛋白表达,也可以下调MCF-7/ADR细胞中PI3K、P-AKT和P-mTOR的表达,但不影响P-EGFR、P-ERK的表达。5.Sambutoxin增强K562/ADR和MCF-7/ADR细胞对Adr敏感性的机制研究流式细胞术检测结果显示,sambutoxin能增加K562/ADR和MCF-7/ADR细胞中Adr和Rh123的细胞内积累,并且20μM sambutoxin的作用明显优于VER。Western blot检测结果表明,sambutoxin通过AKT/NF-κB信号途径而减少K562/ADR和MCF-7/ADR细胞中P-gp的蛋白表达,而P-gp蛋白表达与增加耐药细胞内ROS水平无明显相关性。此外,分子对接结果表明,sambutoxin分子与P-gp分子(PDB代码:6QEX)的Gln-725和Asn-721形成两个氢键相互结合,对接得分为8.2,接近VER与P-gp的对接得分(9.2),明显高于Adr与P-gp的对接得分(5.6)。实验结论1.Sambutoxin显著增强Adr对K562/ADR和MCF-7/ADR细胞的生长抑制作用,在K562/ADR细胞中作用更显著。Sambutoxin和Adr合用不能增强阿霉素对敏感K562细胞株以及敏感MCF-7细胞株的细胞毒性作用。2.Sambutoxin和Adr合用显著上调两株耐药细胞中ROS的水平。3.Sambutoxin显著增强了 Adr诱导K562/ADR和MCF-7/ADR细胞凋亡作用,与上调细胞内ROS产生,诱导线粒体凋亡通路中抗凋亡蛋白Bcl-2下调、促凋亡蛋白Bax上调、Caspase 3以及PARP裂解增多有关。4.Sambutoxin和Adr合用可显著下调两种耐药细胞中PI3K/AKT/mTOR、EGFR/ERK信号通路中的蛋白表达,仅可下调K562/ADR细胞中EGFR/ERK信号通路中的蛋白表达。5.Sambutoxin可与P-gp竞争性结合,抑制P-gp的外排泵活性,降低P-gp的蛋白表达,从而增加了耐药细胞中Adr的积累,逆转Adr的耐药性。该作用与MRP1、GSTπ和TopoⅡα等耐药蛋白的表达无关,与上调耐药细胞内ROS水平无明显相关性。