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背景:糖尿病是当今世界第三大非传染性疾病,而“第一大糖尿病国家”就是中国的现况。若血糖长期持续增高,会使微血管、大血管受损,并危及脑、心、肾等其他重要器官。创伤或癌症导致的大面积组织缺损的重建仍然是外科医生面临的治疗挑战。自体组织移植是治疗这些缺损的现行金标准。另一方面,自体组织移植的成功率受限于缺损大小和供区并发症。因此,如何修复糖尿病患者大面积骨缺损这一问题变得更为紧迫且棘手。一个新的领域—骨组织工程开始兴起了。血管化不足是组织工程中修复大量骨缺损的挑战之一,因为氧气等营养物质在成骨过程中起着非常重要的作用,而血管最多只能为直径100-200um范围内的组织供氧,如果不能得到及时有效的供氧,尤其是组织工程骨的中心,将引起组织坏死。骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal cells,BMSCs)之所以能成为骨组织工程理想的种子细胞,是因其具有自我复制能力,且有向多种细胞分化的潜力、免疫原性低等特点,然而还不能有效的解决血管化的问题。而内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)因其能增殖、分化为血管内皮细胞,参与血管的修复再生,且免疫原性低,所以为组织工程骨的血管化带来了一丝希望。有研究表明,将BMSCs与EPCs直接共培养不仅促进了BMSCs向成骨细胞分化,而且也促进EPCs向血管内皮细胞分化。细胞膜片技术是通过使用物理的方法,将扩增融合的细胞与培养皿底壁分离形成膜片,避免传统细胞接种方式导致细胞大量流失及浪费,这种技术已被证实是组织工程中有效的方法。目的:本实验研究目的旨在探索高糖环境分别对BMSCs增殖、成骨分化能力的影响,对EPCs增殖、成血管能力的影响;探索BMSCs复合EPCs膜片在糖尿病大鼠颅骨极限缺损的骨再生修复中的作用。方法:1.密度梯度离心法配合差速贴壁法分离大鼠BMSCs及EPCs,通过成脂、成骨及成软骨诱导鉴定骨髓间充质干细胞,通过双荧光染色实验及Matrigel小管形成实验鉴定内皮祖细胞。利用膜片培养液连续诱导培养BMSCs、EPCs膜片及BMSCs与EPCs双细胞膜片,大体及扫描电镜观察细胞膜片结构。2.首先筛选高糖浓度,配制不同糖浓度的培养基,对BMSCs及EPCs进行分别培养,绘制其生长曲线,选取合适糖浓度,后续实验全部使用此糖浓度;将高糖培养基作用于BMSCs,使用ALP活性及RT-PCR检测其对BMSCs成骨分化的影响;将高糖培养基作用于EPCs,使用Matrigel小管形成实验、RT-PCR及WB实验检测其对EPCs成血管分化能力的影响。3.高脂高糖饮食配合注射STZ构建II型糖尿病大鼠模型,再构建T2DM大鼠颅骨双侧极限骨缺损模型,缺损为直径4mm的圆形。将大鼠随机分为4组,缺损处分别植入不同细胞膜片,分为(A)空白对照组;(B)EPCs膜片组;(C)BMSCs膜片组;(D)BMSCs/EPCs双膜片组。术后八周处死大鼠后取出颅骨,Micro-CT扫描并分析新生骨的骨小梁数目(Tb.N),骨体积分数(BV/TV),骨小梁间隙(Tb.Sp),骨小梁厚度(Tb.Th)。4.统计学分析,计量资料以均数±标准差表达,实验数据的统计分析是使用SPSS17.0统计软件进行的,两组数据均数的比较使用两独立样本t检验(Independent-samples T test),多个样本的均数比较,若方差齐则使用单因素方差分析(one way of Variance analysis),若不齐则将数据进行平方根转换后使用方差分析,多个样本均数两两之间进行比较,若方差齐则行LSD事后检验(LSD post hoc test),若不齐则使用Games-Howell检验,P<0.05表示差异有统计学意义。结果:1.使用密度梯度离心法配合差速贴壁法成功分离出大鼠BMSCs及EPCs,并鉴定BMSCs具有多向分化潜能,EPCs具有成血管分化潜能。培养好的细胞均呈半透明乳白色薄膜样物向中间卷曲,能够完整地从培养皿底分离,并且具有一定的弹性。扫描电镜下显示,三组膜片均有细胞外基质沉积并附着在其表面,且BMSCs/EPCs复合细胞膜片表面较其余两组更光滑。2.CCK8结果显示,增加培养基糖浓度会抑制EPCs增殖,但30mmol/L糖浓度组BMSCs增殖能力较5.5mmol/L组强,而太高的糖浓度如44mmol/L则会抑制BMSCs的增殖能力(P<0.05),因此本实验选用30mmol/L糖浓度作为高糖实验组。高糖环境下,BMSCs的ALP活性降低(P<0.05),RT-PCR检测显示成骨相关基因Runx2及Osterix表达均下降(P<0.05)。高糖环境下,EPCs增殖能力明显减弱,小管形成显著减少,RT-PCR及WB结果显示VEGF在基因及蛋白水平的表达均下降(P<0.05)。3.高脂高糖饮食配合STZ注射法成功构建T2DM大鼠模型,膜片植入8周后处死大鼠,Micro-CT结果显示对比其余三组,双膜片组骨体积分数最高,骨小梁数目最多,骨小梁厚度最厚,骨小梁间隙最小,因此BMSCs/EPCs双膜片组修复颅骨缺损能力最好,且差异有统计学意义。结论:1.密度梯度离心法配合差速贴壁法可成功分离培养BMSCs及EPCs,使用含抗坏血酸的细胞培养基可诱导细胞成膜。2.体外条件下,增加培养基糖浓度会抑制EPCs增殖,但适当增加细胞培养基浓度有利于BMSCs增殖,但太高会抑制细胞增殖。高糖环境下BMSCs成骨分化能力被抑制,EPCs成血管分化能力也被抑制。3.将BMSCs及EPCs共培养的细胞膜片运用于II型糖尿病大鼠颅骨双侧极限骨缺损中,可显著促进骨再生修复。本研究进一步推动了以细胞膜片为基础的骨组织工程的发展,为血管化骨组织工程的进一步研究和临床应用提供了实验依据。