Piezo机械敏感离子通道是2010年由Coste[1]等发现的一类机械敏感离子通道。该词来源于希腊语（p′esi）表示压力的意义，表明其可以被压力激活的特性。该通道家族包含有Piezo1和Piezo2两个结构和基因类似的蛋白，他们在包括膀胱、结肠和肺等多种组织中有表达，Piezo2在背根神经节表达丰富。这些蛋白预计包含24-36个的穿膜片段，既往的电压门控钠离子和钙离子通道结构包含六个四折叠的穿膜片段，Piezos显然代表了一类新型的膜蛋白家族。该研究小组运用RNA干扰技术敲除培养的小鼠背根神经细胞的Piezo2可以抑制压力引发的快适应机械敏感电流。故而认为该通道家族在压力的机械感受方面具有重要意义。成牙本质细胞是来源于神经嵴的终末分化细胞，其位于牙髓感受最前沿的细胞，虽然他们与牙髓神经纤维并无直接的突触连接[2]，但是由于成牙本质细胞突起向牙本质小管内延伸，而众多的离子通道在成牙本质细胞有表达，故而推测成牙本质细胞是一个具有机械敏感性的细胞[3]。Piezos是否在成牙本质细胞上有表达尚未可知，他在成牙本质细胞感受牙本质小管液的流体运动中扮演何种角色是个值得探讨的问题。本研究在成牙本质细胞其他机械敏感离子通道研究的基础上，采用免疫组化、免疫荧光双标、荧光金逆追踪技术观察Piezo机械敏感离子通道家族在成牙本质细胞的表达和定位，及其与神经纤维和纤毛的关系；通过观察胚胎和干细胞诱导分化过程中通道蛋白的表达情况，推测其在干细胞分化中的作用。采用钙离子测量系统观察离子通道在成牙本质细胞感受机械刺激时的生理学作用。本研究首次围绕Piezo这一新的机械敏感离子通道可能在成牙本质细胞感受、传导机械刺激中的作用这一核心问题，深入探讨牙髓痛觉感受、传导机制和成牙本质细胞分化作用，为揭示牙本质过敏的关键致病机理奠定理论基础，有可能为牙本质过敏的治疗开拓新思路。研究分为以下三部分内容：一、Piezo蛋白的表达定位和追踪研究本实验旨在通过PCR、实时定量PCR和免疫荧光标记观察到Piezo蛋白在成牙本质细胞的表达，同时比较了不同细胞、组织该通道蛋白的表达量，证实在三叉神经节和成牙本质细胞中均有较高表达，在牙周膜组织也有少量表达。免疫荧光的标记证实其主要表达在成牙本质细胞靠近牙本质侧，而且可见到由于其主要表达与成牙本质细胞突起而环绕形成的黑色圆孔，应为成牙本质小管的轮廓。Piezo通道蛋白表达于成牙本质细胞及牙髓内的神经细胞和纤维，通过与NF160分子的共染，可以见到其表达区域大致相当，甚至可见Piezo在成牙本质细胞突起前沿表达，推测其可能比神经纤维更为靠前的感受牙本质小管内的液体流刺激。通过磨切大鼠表面牙釉质开放牙本质小管，涂抹荧光金进行逆行追踪。可以发现经过一周，荧光金成功被运输到三叉神经节内而与Piezo共染。由此推断：成牙本质细胞突起可能是整个牙髓感受外界刺激的最前沿，而且，由于Piezo与神经标志物NF160共同表达与成牙本质细胞、牙髓神经纤维和三叉神经细胞，而开放牙本质小管口的荧光金被成果逆行运输到三叉神经节内，故而推测成牙本质细胞是一个具有某些神经细胞特性的感受器细胞，而Piezo作为一个已经证明了的机械敏感离子通道可能在其中扮演了感受器的角色。二、Piezo通道蛋白的体内外功能研究通过对体内外成牙本质细胞受到刺激时的通道进行观察，进一步了解该通道蛋白的功能。实验包括使用Bioflux模拟小管液流动造成的流体剪切力观察OLC细胞受力后的电生理学行为的体外实验和在大鼠牙本质暴露模型对牙本质施加影响，采取不同时间点的大鼠牙髓标本，对其RNA转录水平进行观察，以判断长时间牙本质暴露带来的成牙本质细胞长时间受力的可能影响。研究发现：OLC细胞在0.5dyne/cm2的流体剪切力作用下，细胞内钙离子浓度出现显著升高，给予GsMTx4[4]这种特异性的Piezo通道阻滞剂后，钙离子浓度逐步降低。推测：成牙本质细胞是压力敏感型细胞，0.5dyne/cm2的剪切力可以激活其压力敏感电流，而Piezo通道特异阻滞剂可以有效的减低钙离子浓度，怀疑Piezo通道在成牙本质细胞压力激活的过程中有重要作用。在大鼠牙本质暴露模型，Piezo通道蛋白的表达表现出缓慢增加的趋势，而且柠檬酸饮水组与单纯的牙本质暴露组差异不明显。推测长期的外界刺激可能造成离子通道的表达增加，这可能是适应性的表达变化。三、Piezo通道蛋白在干细胞分化过程中的功能研究通过PCR法，我们观察到牙髓干细胞并不表达Piezo通道蛋白，为了进一步了解Piezo通道蛋白在发育中的时空表达及其意义，我们通过免疫荧光染色对胚胎期和出生后的小鼠各个时期牙胚进行研究，发现Piezo1和2从E16.5到PD7的牙胚发育及牙本质形成早期均无明显表达。初步怀疑：Piezos是在成牙本质细胞的中晚期才开始表达，而再其初期，成牙本质细胞并不具备压力感受性，故而相关的压力感受器还没有表达。进一步的实验发现：通过对牙髓干细胞矿化诱导和神经向诱导，发现矿化诱导21天后，免疫细胞荧光染色发现Piezo仅有非特异性的表达，而使用缺氧脑组织匀浆诱导牙髓干细胞向神经向的诱导发现，48小时诱导过程中，Piezo表达逐步增加。这个趋势在RNA水平和蛋白水平都得到验证。由此推测：Piezo通道蛋白在干细胞神经方向的分化中逐步增加，因而是其神经性功能的体现，怀疑其与细胞感受压力刺激的功能有关，进一步验证了成牙本质细胞的神经感受功能。