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我国干旱、半干旱地区约占国土面积的二分之一,干旱胁迫已经成为这些地区作物生长的主要限制因子之一。在干旱胁迫地区能生长的植物在长期进化过程中形成了多种应答干旱胁迫的机制。干旱胁迫时通过调控气孔保卫细胞的生理生化特性来改变气孔的导度和开度,进而调控植株的蒸腾作用减少水分丧失是植物应答干旱胁迫的一种重要机制。质膜H+-ATPase是植物细胞膜上表达最为丰富的蛋白,调控植物体内许多重要的生理过程,参与植物对多种生物与非生物胁迫的应答。在受到干旱胁迫时,植物叶片气孔的开闭主要受质膜H+-ATPase的调节,因此在水分胁迫下质膜H+-ATPase活性变化是植物适应水分胁迫的重要机制之一。14-3-3蛋白是在真核细胞中发现的一类高度保守的调控蛋白,通过与磷酸化质膜H+-ATPase的C末端结合而增加其活性,而质膜H+-ATP酶的磷酸化水平受许多环境因素的调节。蚕豆是一种对干旱较敏感的C3植物,由于其气孔保卫细胞大容易观察,叶片表皮条容易制备,也是植物学领域用来研究植物应答干旱胁迫机理的一种常用的模式植物,本论文用PEG模拟干旱胁迫处理两个蚕豆栽培种(一种栽培于黄壤上的蚕豆简称YV),另一种栽培于红壤上简称RV),研究YV和RV叶片14-3-3蛋白和质膜H+-ATPase应答PEG模拟干旱胁迫的分子机理,主要取得以下研究结果：1.在水培条件下用聚乙二醇(PEG)模拟干旱胁迫处理YV和RV,分析蚕豆叶片生理特性与14-3-3蛋白及质膜H+-ATPase的表达、互作及活性的相关性。结果发现在2%、5%和10%PEG处理条件下,随处理浓度和时间的增加,两种蚕豆植株失水率逐渐上升,叶片蒸腾速率和气孔传导率逐渐下降。在所有相同处理条件下,YV植株失水率小于RV,而叶片蒸腾速率和气孔传导率下降幅度也大于RV,说明YV的耐旱性比RV强。在相同处理下YV叶片可溶性蛋白、可溶性糖、游离脯氨酸的含量均高于RV,说明YV在干旱胁迫下的渗透调节能力强于RV；在抗氧化酶体系中,随着PEG胁迫浓度的升高,两种蚕豆叶片SOD和POD活性呈逐渐升高的趋势,但在所有浓度PEG胁迫下YV叶片的SOD和POD活性均显著高于RV,使其叶片中H202含量高于RV。用RT-PCR分析两种蚕豆叶片中4种不同亚型14-3-3基因和2种质膜H+-ATPase (VHA)转录水平的变化,结果说明两种蚕豆叶片中4种14-3-3基因和2种VHA基因本底的转录水平相似,5%的PEG胁迫对YV和RV叶片中4种14-3-3基因和2种VHA基因的转录都有诱导作用,但对RV的诱导作用强于YV。随着5%PEG处理时间的增加,YV叶片质膜H+-ATPase磷酸化水平及其与14-3-3蛋白的结合受到的抑制作用比RV强,其叶片质膜H+-ATPase和H+-泵活性下降的速度也比RV的快,YV叶片气孔开度减小的幅度也大于RV,因此其叶片蒸腾速率和气孔传导率也就小于RV,说明这是YV耐旱性比RV强的一个分子机制。2.很多研究结果说明脯氨酸(Pro)、赤霉素(GA)和甜菜碱能增加植物的吸水能力和耐干旱性。本研究在5%PEG模拟的干旱胁迫下分别添加Pro、GA和甜菜碱处理两种蚕豆,考察Pro、GA和甜菜碱缓解两种蚕豆干旱胁迫作用与叶片质膜H+-ATPase活性的相关性。结果说明与单独的PEG处理相比,在PEG胁迫下随着添加Pro、GA和甜菜碱浓度的增加,两种蚕豆植株的失水率逐渐下降,气孔传导率和蒸腾速率有所下降,证实添加Pro、GA和甜菜碱都具有缓解PEG模拟干旱胁迫两种蚕豆的作用。免疫共沉淀(COIP)分析结果表明在PEG胁迫下添加Pro、GA和甜菜碱后,RV叶片中质膜H+-ATPase的磷酸化水平及其与14-3-3蛋白的结合能力有所增强,质膜H+-ATPase活性在添加Pro、GA时有所下降,在添加甜菜碱后有所升高,H+-泵活性与单独的PEG处理相比没有差异,但叶片气孔开度显著增加,说明质膜H+-ATPase与14-3-3蛋白的相互作用并不参与Pro、GA和甜菜碱缓解PEG模拟干旱胁迫两种蚕豆的作用,因为叶片蒸腾作用减少的幅度较小,Pro、GA和甜菜碱缓解PEG胁迫可能主要通过增加蚕豆的吸水能力实现。3.腺苷-5’-单磷酸(AMP)和钒酸盐(VA)都是质膜H+-ATPase的抑制剂,前者能够抑制14-3-3蛋白与磷酸化质膜H+-ATPase的结合而降低质膜H+-ATPase的活性；而IAA和MgCl2是质膜H+-ATPase的激活剂,能够增强质膜H+-ATPase的磷酸化作用并促进14-3-3蛋白与磷酸化质膜H+-ATPase的结合,提高质膜H+-ATPase活性。为了进一步考察在PEG模拟干旱胁迫下两种蚕豆叶片中质膜H+-ATPase与14-3-3蛋白对气孔生理特性的调控作用,在5%的PEG模拟干旱胁迫下用IAA和MgCl2处理YV后,与单独PEG处理对比,IAA和MgCl2存在使植株失水率显著升高,叶片蒸腾速率和气孔传导率也显著增加,H202含量下降。COIP分析结果表明质膜H+-ATPase磷酸化水平升高,与14-3-3蛋白的结合能力增强,酶活性和H+泵活性也显著升高,叶片气孔开度增大,说明IAA和MgCl2通过降低H202含量、增加质膜H+-ATPase与14-3-3蛋白的相互作用来增加气孔开度和叶片的蒸腾作用,加剧PEG干旱胁迫的效果。添加AMP和VA处理RV,结果发现与单独的PEG处理相比AMP和VA的存在使RV植株失水率显著减少,同时叶片蒸腾速率和气孔传导率均显著降低,H202含量下降。COIP分析结果表明RV质膜H+-ATPase磷酸化及其与14-3-3蛋白的相互作用水平降低,酶活性和H+-泵活性下降,气孔开度减小,说明AMP和VA可通过增加H202含量来抑制质膜H+-ATPase与14-3-3蛋白的相互作用来降低RV气孔开度和叶片的蒸腾作用,缓解PEG的干旱胁迫。这些结果说明在PEG模拟干旱胁迫下质膜H+-ATPase与14-3-3蛋白对两种蚕豆叶片中气孔生理特性有重要的调控作用。在干旱胁迫外源施用AMP和VA可增加蚕豆的耐旱能力。4.最近的研究表明H202能抑制质膜H+-ATPase的磷酸化及其与14-3-3蛋白的结合,从而降低H+-ATPase活性并减少离体蚕豆表达条的气孔开度。抗坏血酸(AsA)是一种常用的H2O2清除剂,H2O2的产生依赖于脱落酸(ABA),钨酸钠是ABA合成抑制剂,钨酸钠的存在也抑制H2O2的产生。在PEG胁迫下YV叶片中产生的H2O2含量高于RV,为了解在PEG胁迫下H2O2是否参与RV和YV叶片质膜H+-ATPase活性的调控,在5%PEG干旱胁迫下添加不同浓度AsA和钨酸钠处理YV,结果表明随着AsA和钨酸钠浓度的增加,YV植株失水率逐渐上升,叶片蒸腾速率和气孔传导率也显著上升,YV叶片H2O2的含量下降。COEP分析结果表明添加AsA和钨酸钠使YV叶片质膜H+-ATPase磷酸化水平升高,质膜H+-ATPase与14-3-3蛋白的相互作用增强,酶活性和H+泵活性上升,气孔开度增大。在5%的PEG胁迫下添加不同浓度的H2O2处理RV,结果表明随着H2O2浓度的升高,RV植株失水率逐渐下降,叶片蒸腾速率和气孔传导率也显著下降,COIP分析结果表明添加H2O2使RV叶片质膜H+-ATPase磷酸化水平下降,同时与14-3-3蛋白的结合减弱,酶活性和H十泵活性降低,气孔开度减小。这些结果证实在PEG胁迫下H2O2参与RV和YV叶片质膜H+-ATPase活性的调控,在干旱胁迫下外源施用H2O2提高蚕豆耐旱能力。