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第一部分高通量单核苷酸芯片筛选肝细胞肝癌拷贝数变异及相关基因目的：探讨全基因组拷贝数变异(Copy number variation, CNV)在肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)患者中的变化情况以及与HCC的关系。方法：1、用Affymetrix 500K SNP (Single nucleotide polymorphism,单核苷酸多态性)芯片检测50例试验组(乙型病毒性肝炎(Heptesis B virsus, HBV)(?)日性HCC患者)和50例对照组(乙型病毒性肝炎阳性无HCC对照人群)中的CNV；2、在检测出的HCC可能相关的CNV中,随机挑选5个CNV,用实时定量PCR(SYBR Green real-time Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)在282例试验组(乙型病毒性肝炎阳性HCC患者)和278例对照组(乙型病毒性肝炎阳性无HCC对照人群)中验证芯片筛选结果。结果：1、检测到HCC可能相关的拷贝数变异区域(CNV regions)共有13个,其中10个为拷贝数扩增,3个为拷贝数缺失。2、经与DGVs数据库和UCSC数据库比对,13个拷贝数变异区域中,6个与DGVs数据库报道的存在于正常人群的CNV区域重叠；2个与UCSC数据库报道的在一些遗传病中出现的CNV区域一致；1个共存于DGVs数据库和UCSC数据库中；4个为新发现的CNV区域(2q14.3,6q16.1,8q23.2,17q22的扩增)。3、发生率较高的为2个扩增区域：2号染色体2p12(64%)和5号染色体5q34(60%),以及一个缺失区域：15号染色体15q23(62%)。4、随机挑选5个CNV区域(2q14.3,5q34,8q23.2,7q1 1.23,17q25.3),经实时定量PCR检测证实与芯片结果一致。5、共检测到CNV相关的HCC可能相关基因有14个,其中5个基因首次在肝细胞肝癌中报道。结论：肝细胞肝癌患者中存在CNV,且可能与HCC的发生有重要关系,并有可能成为遗传易感标志,同时有助于寻找HCC的相关基因。第二部分肝细胞肝癌可能相关基因相互关系及功能分类的网络构建目的：探讨肝细胞肝癌可能相关基因的相互关系及功能分类。方法：用GO、MAS3.0、DAVID和STRING服务器在线分析检测到的14个CNV相关的HCC可能相关基因,挖掘这些基因可能参与的信号通路,相互作用方式,功能分类与蛋白网络,预测其在肝细胞肝癌中可能的作用方式和通路。结果：14个CNV相关的HCC可能相关基因主要涉及蛋白磷酸化,质膜构成,序列变异,可变剪接,转录,剪接变异,质膜,胞外区,诱变位点,疾病基因突变,胞膜构成,有转录本调节活性,二硫键,信号,信号肽,多态性,剪接变异体,糖蛋白。STRING分析发现这14个CNV相关的HCC可能相关基因网络中有两个重要节点：GABRG2和KIF2B,且均和癌症有关。结论：14个CNV相关的HCC可能相关基因在HCC的发生、发展中可能起重要作用。第三部分NOVA1基因和拷贝数变异区域14q12以及肝细胞肝癌关系的研究目的：探讨拷贝数变异区域14q12与相关基因NOVA1(Neuro-oncological ventral antigen 1,肿瘤神经腹侧抗原)之间的关系,以及两者与HCC之间的相互关系。方法：1、实时定量PCR(SYBR Green real-time PCR, RT-PCR)检测282例试验组(HBV阳性HCC患者)和278例对照组(HBV阳性无HCC对照人群)外周血中14q12拷贝数变异,扩大样本以验证14q12拷贝数变异与HCC的关系；2、免疫组化检测120例乙肝阳性HCC患者的肝癌组织、癌旁组织中14q12拷贝数变异区域相关基因NOVA1的蛋白表达水平,以了解NOVA1基因与HCC的关系。3、取40例HBV阳性HCC患者的肝癌组织,免疫组化检测NOVA1蛋白的表达,同时RT-PCR检测14q12的拷贝数变异情况,以了解NOVA1基因与14q12的拷贝数变异之间的关系。结果：1、RT-PCR结果示14q12拷贝数变异区域在282例试验组中拷贝数增高,与对照组相比差异具有统计学意义。2、免疫组化结果示NOVA1蛋白在肝细胞肝癌组织中表达明显高于癌旁组织,差异具有统计学意义。3、在40例HBV阳性HCC患者的肝癌组织中同时检测14q12拷贝数变异及NOVA1蛋白表达,结果显示14q12拷贝数扩增的患者其肝癌组织中NOVA1蛋白亦呈高表达,差异具有统计学意义。结论：1、14q12拷贝数扩增是HCC相关的拷贝数变异区域；2、NOVA1基因为14q12拷贝数变异区域的相关基因；3、NOVA1基因是肝细胞肝癌相关基因,在肝细胞肝癌的发生中可能起重要作用。第四部分NOVA1基因过表达对肝癌细胞生长增殖的影响目的：检测NOVA1基因过表达对肝癌细胞生物学行为的影响。方法：1、使用逆转录PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)法检测(SMMC-7721, HepG2, MHCC97H, MHCC97L, SK-HepG 1, PLC/PRF/5) 6株肝细胞肝癌细胞株及1株正常肝细胞株ATCC L-O2中NOVA1基因的表达,以筛选出低表达NOVA1的细胞株；2、构建NOVA1基因过表达质粒,并转染低表达NOVA1基因的细胞株；3、MTT法检测经转染后肝癌细胞的生长曲线；4、流式细胞仪检测经转染后肝癌细胞的细胞凋亡。结果：1、SMMC-7721细胞株和MHCC97L细胞株为低表达NOVA1基因的肝癌细胞株；2、MTT法检测结果显示转染了过表达NOVA1基因质粒的SMMC-7721细胞和MHCC97L细胞与未转染的SMMC-7721细胞和MHCC97L细胞比较,生长增殖能力明显增强；3、流式细胞仪检测结果显示转染了过表达NOVA1基因质粒的SMMC-7721细胞和MHCC97L细胞的早期凋亡和晚期凋亡均明显减弱。结论：NOVA1基因可促进肝癌细胞的生长增殖、抑制凋亡,是肝细胞肝癌相关基因,对肝细胞肝癌的发生可能有重要意义。第五部分NOVA1基因干扰对肝癌细胞生长增殖的影响目的：检测NOVA1基因干扰对肝癌细胞生物学行为的影响。方法：1、使用逆转录PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)法检测(SMMC-7721, HepG2, MHCC97H, MHCC97L, SK- HepG 1, PLC/PRF/5) 6株肝细胞肝癌细胞株及1株正常肝细胞株ATCC L-O2中NOVA1基因的表达,以筛选出高表达NOVA1的肝癌细胞株；2、构建NOVA1基因干扰质粒,并转染高表达NOVA1基因的HepG2细胞株和MHCC97H细胞株；3、MTT法检测经转染后肝癌细胞的生长增殖；4、流式细胞仪检测经转染后肝癌细胞的细胞凋亡；5、划痕实验检测经转染后肝癌细胞的细胞迁移能力。结果：1、HepG2细胞株和MHCC97H细胞株为高表达NOVA1的肝癌细胞株；2、MTT法检测结果显示转染了NOVA1基因干扰质粒的HepG2细胞和MHCC97H细胞生长增殖能力明显减弱；2、流式细胞仪检测结果显示转染了NOVA1基因干扰质粒的肝癌细胞的凋亡更为明显。3、细胞划痕实验结果显示转染了NOVA1基因干扰质粒的肝癌细胞迁移能力明显减弱。结论：NOVA1基因干扰使肝癌细胞凋亡增加,生长减慢,迁移减弱,亦说明了NOVA1基因可能对肝细胞肝癌的发生有重要意义。