荧光相关光谱（Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCS），是一种通过测定溶液中微区内（通常<10－15L）发光粒子由于运动或化学反应而产生的荧光涨落（荧光强度的明暗变化），并对荧光强度随时间变化的函数进行统计分析，从中获得粒子浓度、扩散系数、化学动力学参数等有关信息的分析方法。FCS于1972年由Magde等人基于波动光谱的概念提出。在其发展之初，由于计算机技术、光学技术以及光学检测技术的限制，人们一直无法减小照射体积、提高信噪比和灵敏度，技术发展缓慢。直到1993年，Rigler等人采用激光共焦技术使检测体积降到10-15L以下，灵敏度得到显著提高，自此FCS技术进入了快速发展通道。 以微流控芯片为代表的微型全化学分析系统(miniaturized total analysis system，?-TAS)，是当今分析领域的热点。经过十余年的发展，其集成度不断提高，同时对芯片中反应过程的表征手段提出了新的要求。荧光相关光谱具有极高的灵敏度，对所分析的过程不产生机械干扰，能够准确地反应微区内荧光粒子的浓度、迁移速率及化学反应动力学常数，且具有双光束交叉相关谱等多种结构模式来适应不同的研究需要。因此，荧光相关光谱势必将成为表征微流控芯片内部过程的有力方法，其二者的联用技术显示出广阔的发展前景。 本论文基于激光共焦构型，构建了一套高灵敏度、高稳定性的荧光相关光谱单分子检测系统。该系统采用激光激发，用高数值孔径物镜使激光束聚焦，并用同一物镜收集样品的荧光，单光子计数器用于实时记录荧光信号，该荧光信号用相关器实时相关。整个系统保持物镜焦点、针孔以及单光子计数器光敏区同轴。光学收集方面采取针孔与单光子计数器直接耦合，使光学收集效率得到更好的提高。在此FCS系统基础上，建立了一套简单有效的FCS与微流控芯片联用装置。该装置通过显微镜与摄像头对芯片通道进行放大成像，可以有效地辅助对焦工作。 本文发展了一套符合与FCS联用要求的微流控芯片制作方法。该种微流控芯片采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）材料与盖玻片杂交而成，经试验证明，联用系统中所得信号与开放体系中所得基本相同。本文同时对PDMS材料的选择、盖玻片的厚度校正及对焦方法等问题进行了讨论。 荧光相关光谱在多组分分析时不用通过分离手段，直接采用数学拟合方法即可获得不同组分的扩散系数。这是其优点，但有时也限制了它的应用，特别是当组分间的分子量差异不很显著时，常规荧光相关光谱就无法有效区分。为解决这个问题，van Orden等人首先将毛细管电泳技术与FCS联用，采用压力驱动，利用电场力使不同组分产生淌度差，对分子量差别较小的R6G和R6G-dUTP混合物进行了组分比例分析，取得了良好的效果。但在试验中由于毛细管侧壁为弧形，使入射激光产生折射，造成焦点形状畸变，所得关联函数用理论模型拟合效果较差，需要额外做条件实验并引入参数对理论模型进行修正。本文利用微流控芯片代替毛细管与FCS联用，由于芯片底部为厚度均匀的盖玻片封装，因此不会对激光造成不良影响。这种改变不仅可以简化实验过程、提高准确率，还可以有效降低样品需求量、减小电泳焦耳热效应。文中应用自组装FCS与微流控芯片联用系统对分子量相近混合物体系：不同比例的罗丹明绿琥珀酸脂与荧光素混合物（常规荧光相关谱无法区分）在单分子水平上进行了分析，取得了令人满意的分析结果。该方法有效地拓展了荧光相关光谱的应用范围，特别适合物质相互作用研究。文中还对FCS数据处理方法中的一些问题进行了讨论。 FCS与微流控芯片联用技术还可以进一步应用于分子相互作用研究、通道内物质迁移机理研究、与高集成度生物芯片联用等研究领域，同时有助于细胞内FCS技术的进展。该技术应用范围和发展前景十分广阔，是未来分析领域研究的重要分支。