Tra2(Transformer2)属前体mRNA剪辑蛋白。在果蝇和哺乳动物中均有表达，在果蝇中是性发育的关键调控蛋白，在哺乳动物中，性别决定的机制与果蝇中完全不同，Tra2可能具有其它的功能。有限的研究提示Tra2蛋白在哺乳动物中可能与发育有关。但该基因在哺乳动物中的表达特征、发育调控及其生理功能和作用机制如何，目前尚不清楚。本论文的目的便是针对上述问题，研究Tra2在神经发育过程中的表达特征及其功能。 基因表达谱分析是研究基因功能及其调节的重要一环。Tra2已知有多种亚型(Tra2β1，2，3，4，5和Tra2α)。如果Tra2参与发育调节，那么作为功能调节的一个方面，它的各个亚型的表达谱是否会随着发育阶段和组织类型的不同而受到调节?对此，我们首先分析Tra2各个亚型在不同发育阶段和不同组织的基因表达谱。其中包括考察在发育过程中是否会有新的Tra2的亚型产生。我们利用RT-PCR扩增的方法，对人胚胎组织中的Tra2进行扩增，在Tra2β扩增时，没有发现新的亚型，但在扩增Tra2α时，发现了一种新的Tra2亚型，它与Tra2α具有相当高的同源性(暂命名为Tra2α2，原有的亚型命名为Tra2α1)。另一方面，为了分析Tra2各个亚型的表达量在不同组织和不同发育阶段之间是否存在差异，我们利用半定量RT-PCR的方法，对不同发育阶段的人胚胎组织中的Tra2α和Tra2β的各mRNA亚型进行了检测。结果显示，在Tra2β各亚型中，Tra2β1和Tra2β5在各种组织中均有表达，其表达量随发育阶段的不同而有变化，但不同组织之间表达量差异较小。而Tra2β3的表达则有明显的组织和发育阶段调控特征。在11周时，所有组织中均未检测到其表达，而在16周时，所有组织中均检测出了Tra2β3条带，但各组织之间表达量变化幅度很大。Tra2β4的表达特征与Tra2β3类似，在11周时，它仅在包括小脑在内的几种组织中表达，在16周也表现出在各组织中普遍表达的特征。在Tra2α的2种亚型中，Tra2α1和Tra2α2在11周和16周均为普遍表达，从11周到16周，绝大多数组织中该两种Tra2亚型的表达都有增加。上述结果从基因表达层次提示：在人类发育(包括神经发育)过程中，对Tra2蛋白的选择性剪辑的调节功能的需求也随不同的组织和发育阶段而变化。 研究表明，Tra2蛋白具有前体mRNA剪辑调节蛋白的特性。因此，与mRNA层次的研究相比，从蛋白质水平上研究Tra2蛋白在发育中的调控可更为直接的复旦大学博士学位论文前体mRNA剪辑蛋白TraZ基因在神经组织中的表达特征、发育调控及功能中文摘要反映该蛋白在发育中的功能。因此，本文进一步在蛋白水平上考察了TraZ表达是否与发育过程相关。为此，我们首先制备了用于检测TraZ蛋白各亚型的特异抗体。我们通过对TraZa和TraZp各亚型的编码序列的比较分析设计了TraZal和TraZ印蛋白的特异抗原片段，在细菌中表达并纯化该片断所编码肤段的GsT融合蛋白，并以此为抗原制备了兔抗TraZal和TraZpl的抗体。在鉴定获得的抗体的特异性之后，我们用获得的抗体和另一种可同时检测全长型TraZpl和截短型的TraZp亚型的抗体(RA301抗体)分别对不同发育期的人胎组织中的肠aZ蛋白进行了Westem印迹检测，结果是:在TraZp的两种蛋白亚型中，仅检测到全长型TraZpl的表达，而截短型TraZp未检测到。说明在肠心p蛋白中，全长型TraZpl蛋白是主要蛋白。TraZpl在发育中的各组织中明显为普遍性表达，但在神经组织中(包括大脑、小脑、延髓和脊髓)中的表达高于非神经组织(肝、心、肺、肾和肠);TraZal蛋白的表达具有明显的组织特异性，除了在神经组织(大脑、小脑、延髓和脊髓)中始终表达外，在非神经组织中，除了在n周的心、肾和16周的心脏组织中检测到表达外，其余组织中均无可检测出的表达。这一结果提示TraZ蛋白在发育中的神经组织中可能有重要功能。 在对TraZ进行了表达分析的基础上，我们进一步对其功能进行研究。首先要考察的是肠aZ蛋白在细胞内发挥功能的场所，即肠心蛋白在细胞内的分布特点。我们选择了在具有神经细胞特性的PFSK一1细胞中表达GFP一TraZ的融合蛋白，并通过激光共聚焦显微镜检测绿色荧光的方法来对TraZ蛋白进行亚细胞定位，结果表明，三种TraZ蛋白(TraZal、a2和邵)均主要集中于细胞核中，呈点状或融合状态，此分布特征与TraZ在核内的剪辑功能相符合，提示在神经细胞中，细胞核是TraZ蛋白的主要功能场所。 已有的研究表明，TraZ蛋白在神经细胞中的表达受到多种因素(如:缺氧后重新给氧、或缺血后恢复供血、神经损伤、神经刺激)调节，提示它在神经系统中具有一定的功能。本文的研究结果也表明，TraZ的表达在神经发育中受到调节，提示它在神经发育中的潜在功能。那么，TraZ蛋白的这些潜在功能对神经发育是否会有影响?若有，会如何影响呢?为此，我们首先研究了TraZ蛋白对神经细胞和神经胶质细胞分化进程的影响。我们利用RA诱导P19细胞株分化作为模拟神经分化过程的模型，在建立稳定地过度表达外源性TraZ蛋白的P19系列细胞株的基础上，通过免疫细胞化学检测(ICC)和Rl’- PCR方法，分析在RA诱导的P19系列细胞的各分化阶段，细胞中表达早期神经元标志性蛋白(p一111?