背景　　伤寒沙门菌(SalmonellaentericaserovarTyphi，S.Typhi)作为一种重要的人类肠道致病菌，从外界环境进入宿主的过程中，系统基因表达调节十分重要。近年来生物信息学、DNA芯片技术、高通量测序技术的发展和应用，使得生物系统基因表达研究进展迅速。在各种生物体内除蛋白质外还存在许多非编码RNA(non-codingRNA，ncRNA)具有调节基因表达作用。这些ncRNA大多在转录后水平调节靶基因表达，参与细菌的各种生理反应，包括代谢调节、群体感应、毒力、铁代谢、氧化应激等。ncRNA的鉴定、功能和调节机制研究已成为当今生物医学的研究热点。　　目的　　本研究小组前期通过高通量测序结合应用生物信息学分析，在S.Typhi中发现了许多新的ncRNAs表达迹象。本研究旨在对S.Typhi中一种新的ncRNA（malS-5UTR）的分子特征进行鉴定，并对其表达特性、对基因表达影响和作用机制开展深入研究。　　方法　　1.malS-5UTR的分子特征鉴定利用高通量测序获得的信息，设计特异性的引物和探针，通过RT-PCR和Northernblot,对malS-5UTR在S.Typhi中的表达进行验证，利用RACE实验分析malS-5UTR的转录起始点和终止点。　　2.malS-5UTR在不同生长条件下的表达特性分析以Northernblot和qRT-PCR分析S.Typhi在不同生长时期malS-5UTR的表达特点。应用同样手段分析S.Typhi在不同应激条件（包括酸、氧及高渗环境下）malS-5UTR的表达特性，并分析各种应激条件下σ因子对malS-5UTR的表达调控作用。　　3.基因缺陷株的表型分析:　　(1)在不同条件下生长曲线的测定以生长时间为横坐标，OD600值为纵坐标绘制生长曲线，观察S.Typhi的malS-5UTR基因缺陷株和对照株在普通条件和酸、氧及高渗应激条件下的生长状况。　　(2)动力实验测定将S.Typhi的malS-5UTR基因缺陷株、bax基因缺陷株和对照株接种于0.3％琼脂糖动力平板，37℃培养一定时间后测量菌圈直径，以分析细菌动力。　　(3)对HeLa细胞的侵袭实验将malS-5UTR基因缺陷株、bax基因缺陷株和对照株在等渗LB中培养至对数期，按MOI20∶1加入HeLa细胞培养孔，培养90min后，将部分细胞破膜，收集菌体后涂板，过夜培养并计菌落数代表细菌粘附细胞水平(T0);另将部分细胞加入庆大霉素继续培养90min后，按上述方法操作，菌落数代表细菌侵袭水平(T90)，以T90/T0代表细菌对HeLa细胞的侵袭能力。　　4.malS-5UTR和bax对S.Typhi系统基因表达影响分析采用基因组芯片分析技术，分析S.Typhi系统基因转录水平表达。将S.Typhi的malS-5UTR基因缺陷株、bax基因缺陷株和对照株在等渗LB中培养4h，提取总RNA，反转录并荧光标记cDNA，与基因组芯片杂交、扫描，将荧光信号数据化并比较菌株间的系统基因表达谱差异。选择部分基因，用实时荧光定量PCR分析其在菌株间的表达差异，以验证芯片分析结果。　　5.malS-5UTR对其靶基因bax表达影响分析构建malS-5UTR表达重组质粒pBAD-malS-5UTR，并电转到S.Typhi野生株，用阿拉伯糖诱导malS-5UTR高表达，用Northernblot和qRT-PCR进行分析bax的mRNA水平。采用了自杀质粒介导的同源重组方法，在S.Typhi野生株染色体bax基因加3×Flag标签序列，然后将pBAD-malS-5UTR导入该菌株，用阿拉伯糖诱导malS-5UTR高表达，用Westernblot观察Bax蛋白水平的变化。　　6.malS-5UTR影响S.Typhi侵袭力作用机制分析将pBAD-malS-5UTR及空质粒pBAD分别电击转化入S.Typhi的bax基因缺陷株中，用qRT-PCR检测侵袭相关基因invF的表达水平，并观察不同菌株对HeLa细胞侵袭能力，以分析malS-5UTR对S.Typhi侵袭力的影响是否与其靶基因bax相关。　　结果　　1.malS-5UTR分子特征鉴定通过S.Typhi转录组分析发现了一个236个核苷酸由bax的负链基因所编码的转录产物，(从bax基因起始密码子上游99nt到137nt)，经Northernblot和RT-PCR分析，确定其在S.Typhi中有表达，且全长约有2000nt。5-RACE实验结果显示其转录起始点位于malS基因起始密码子的上游453nt处。3-RACE实验有多个结果，最长的一个片段位于malS基因起始密码子的下游1112nt。考虑到在Northern分析中并没有发现多个不同的片段，malS-5UTR和malS重叠且和malS转录方向相同，结合生物信息学基因启动子分析结果，认为与bax的mRNA互补的转录产物实际就是malS的mRNA的5非翻译区(5untranslatedregion,5UTR)，因此命名其为malS-5UTR。　　2.malS-5UTR在S.Typhi中的表达特性Northernblot和qRT-PCR结果表明，malS-5UTR在S.Typhi各生长时期和应激条件下均有表达，且在迟滞期(OD600=0.4)表达量最高，在酸、氧及高渗应激下的表达量均下降。在各种应激条件下，rpoE和rpoS缺陷株中malS-5UTR的表达均少于野生株，表明其转录与RpoE和RpoS相关。　　3.malS-5UTR基因缺陷株的表型分析　　(1)对伤寒沙门菌生长的影响与野生株相比，malS-5UTR基因缺陷株的生长速度明显减慢，表明malS-5UTR可以促进细菌生长;在酸及高渗应激时，malS-5UTR缺陷株的生长无明显差异;在氧应激时，malS-5UTR基因缺陷株的生长速度明显减慢，表明mal5UTR可以促进细菌在氧应激下的生长。　　(2)对伤寒沙门菌动力的影响动力分析表明，与野生株相比，malS-5UTR缺陷株的动力圈明显增大，表明malS-SUTR参与了沙门菌动力的调节。　　(3)对伤寒沙门菌侵袭力的影响与野生株相比，malS-5UTR基因缺陷株对上皮细胞的侵袭力增强，表明malS-5UTR可能参与了细菌侵袭力的调节。　　4.malS-5UTR对S.Typhi系统基因表达影响分析芯片分析结果显示，与野生株相比，malS-5UTR缺陷株中有334个基因表达发生明显变化，其中254个基因表达上调，主要包括鞭毛、动力和侵袭相关基因，有80个基因表达下调，主要为一些核糖体和代谢相关的基因;为了验证芯片结果的可靠性，选取其中部分表达变化的基因进行荧光定量PCR验证，结果显示所选基因表达变化与基因芯片分析结果一致。研究表明malS-5UTR参与S.Typhi系统基因表达调节。　　5.malS-5UTR对其靶基因bax表达影响分析Northernblot和qRT-PCR分析结果显示，随着malS-5UTR表达诱导时间的延长，bax的mRNA水平逐渐减少，表明malS-5UTR可降低baxmRNA的稳定性。Westernblot分析结果显示，和空载体对照株比较，随着诱导时间的延长，Bax蛋白水平逐步下降。这些研究结果表明，Bax的表达受到malS-5UTR的负向调节。　　6.malS-5UTR影响S.Typhi侵袭力作用机制分析　　(1)Bax对S.Typhi侵袭力影响分析与野生株相比，bax基因缺陷株对上皮细胞的侵袭力增强，表明Bax可能参与了细菌侵袭力的调节。基因组芯片分析结果显示，与野生株相比，bax缺陷株中有67个基因表达发生明显变化，其中55个基因表达上调，主要为SPI-1、侵袭和毒力相关基因;有12个基因表达下调，主要为代谢相关基因。用qRT-PCR分析其中部分基因的表达，结果显示与基因芯片分析结果一致。研究表明Bax可能是S.Typhi侵袭的负调节因子，malS-5UTR可通过抑制Bax的表达而增加S.Typhi的侵袭力。　　(2)malS-5UTR影响S.Typhi侵袭力与Bax相关性分析和含有空载体的bax基因缺陷株比较，在bax基因缺陷株中malS-5UTR高表达后，侵袭调节基因invF的mRNA水平显著增加，同时细菌对HeLa细胞的侵袭力也明显增强。结果表明malS-5UTR对侵袭的影响并不完全通过Bax，也可能通过其它途径进行。　　结论　　1.首次鉴定了S.Typhi中存在表达的malS基因上游一段非编码区为malS-5UTR。　　2.malS-5UTR基因缺失可增强细菌的动力和对HeLa细胞的侵袭力。　　3.malS-5UTR基因缺失后能导致细菌发生系统性基因表达变化，涉及鞭毛结构和功能、侵袭、调节蛋白及部分代谢相关的基因。　　4.malS-5UTR高表达降低靶基因bax的表达。　　5.Bax可能是伤寒沙门菌侵袭相关的一个负调节因子。　　6.malS-5UTR可通过抑制bax表达，增强沙门菌的侵袭力，但不是唯一途径。