双组分信号转导系统（Two-component signal transduction system,TCS）是目前已知的最简单的细胞信号系统之一,调控细菌多种多样的生命活动。该系统主要由两种不同的蛋白组成,一种是组氨酸激酶（Histidine kinase,HK）,属于跨膜的传感蛋白,另外一种是反应调节蛋白（Response regulator,RR）,位于细胞质中。组氨酸激酶通常与环境中的信号相互作用,在此过程中被磷酸化,再将磷酸基团转移到反应调节蛋白上,磷酸化的反应调节蛋白通过对操纵子的阻遏或者激活作用调控下游基因的表达。TCS系统广泛存在于细菌中,调控多样化的信号转导过程,主要体现在HK和RR蛋白的功能多样性上。HK具有激酶和磷酸酶双功能,RR蛋白除了是HK蛋白的底物以外,还具有自磷酸化或者自去磷酸化功能。虽然TCS的信号转导路径已经明确,但其信号调控的个性化分子机制尚不清楚,不同RR蛋白的磷酸化速率和构象变化各具特色,因此研究RR蛋白的结构和磷酸化过程具有极为重要的生物学意义。PhoB是PhoR/PhoB双组分信号转导系统中的反应调节蛋白,隶属于最大的RR家族——OmpR/PhoB家族。它是双结构域蛋白,包含receiver domain（PhoBN）和effector domain,其中PhoBN是PhoB蛋白的磷酸化结构域,也是本文研究的目标蛋白。目前科学家已经通过X-ray晶体衍射技术获得了PhoBN在自由态和模拟磷酸化态下的晶体结构,这两种结构分别通过a1-a5界面以及a4-a5-b5界面形成二聚体。其中以a1-a5为界面的二聚结构较少被观察到,而且PhoBN的构象变化与磷酸化机制之间的关系并不清楚。本文通过液体核磁共振（NMR）技术研究反应调节蛋白PhoBN的溶液结构和动力学性质,期望阐述其构象变化与磷酸化机制之间的内在联系。通过主链归属对蛋白质的二级结构进行预测,我们发现PhoBN在溶液中保持着与晶体结构类似的（a/b）5折叠模式。浓度稀释、弛豫速率测量以及PRE等实验显示PhoBN在溶液中存在单体和二聚之间的平衡,而且PhoBN蛋白通过不同的二聚界面形成了多种构象,这种二聚平衡的构象并不依赖于磷酸化过程。BeF3-是一种磷酸类似物,可以稳定反应调节蛋白的磷酸化态,有助于研究RR蛋白磷酸化的动态过程。绝大多数反应调节蛋白的磷酸化过程需要二价金属离子Mg²⁺参与配位,但是PhoBN在没有Mg²⁺的情况下也能和BeF3-结合,当Mg²⁺存在时PhoBN实现完全磷酸化。由于野生型PhoBN存在多种构象的交换,NMR信号不均一,不利于磷酸化机制的研究。我们构建的PhoBN F20D突变体主要以单体形式存在,NMR信号强度均匀,其生物活性与野生型的PhoBN一致,可以作为磷酸化机制的研究对象。1H-15N HSQC谱显示,在没有Mg²⁺存在时,BeF3-能够捕捉到PhoBN F20D的瞬态活性构象,CPMG以及CEST等方法均证实自由态PhoBN F20D在溶液中的确存在构象交换的现象。我们进一步研究了Mg²⁺存在时PhoBN F20D的磷酸化机制,发现Mg²⁺结合会造成蛋白helixa4,loopb3-a3残基的化学位移变化。对这一区域的残基进行突变,发现D+1（W54）,D+2（M55）以及T+2（R85）位点的残基突变会减弱磷酸化程度,D+3（L56）位点突变会使蛋白质完全失去磷酸化能力。其中W54靠近磷酸化位点D53,这一残基在磷酸化之后存在两种构象,而且它可以和helixa4上的E88交替地与磷酸化位点相互作用,调控蛋白的激活构象,暗示PhoBN的磷酸化过程和helixa4的运动密不可分。总之,本论文主要利用液体NMR的方法对自由态PhoBN在溶液中的构象进行了研究,提出蛋白存在单体和二聚的平衡,且二聚界面存在多种结合模式。通过对PhoBN F20D突变体的研究,我们发现蛋白单体还存在自由态和磷酸化态的构象交换,BeF3-有助于稳定其磷酸化态。同时探究了Mg²⁺的结合对蛋白结构的重要影响以及多个氨基酸位点对磷酸化过程的作用。我们的研究成果为探究双组分信号转导系统的信号转导机制提供了实验基础,同时也有助于进一步揭示反应调节蛋白磷酸化的作用机理。