论文部分内容阅读
目的:神经干细胞是分布于神经系统的、具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞,能生成多种神经细胞。由于其免疫原性低又具有良好的迁移性能,被广泛用于神经损伤后再生与修复领域。神经干细胞具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力,但其分化受到多种因素影响,包括细胞外环境、营养素、细胞因子、信号通路和转录因子等。而在神经损伤以及神经退行性疾病的局部微环境中,神经干细胞往往分化为神经胶质细胞,如何控制神经干细胞在特定环境下分化为预期的终末细胞是待解决的关键问题。沉默信息调节因子2相关酶1(silent information regulator 2 homolog 1,SIRT1)是一种NAD+依赖的脱乙酰基酶,通过对组蛋白及多种非组蛋白进行去乙酰化修饰参与细胞衰老、细胞分化、细胞凋亡、细胞糖脂代谢等重要的生理过程。已有研究发现SIRT1在神经干细胞的分化过程中发挥一定的调控作用,但有关其调控方向的研究结果不一致。例如,研究显示诱导神经干细胞分化后SIRT1水平显著下降,过表达SIRT1使神经干细胞向神经元的分化减少;但也有研究指出抑制SIRT1使神经干细胞的分化能力显著提高。因此,有关SIRT1与神经干细胞分化过程的研究现状是,SIRT1具有调控神经干细胞分化的作用,但究竟是神经干细胞分化的促进因子还是抑制因子,目前尚没有统一结论。选择性剪接(Alternative Splicing,AS)是指m RNA前体(Pre-m RNA)通过选择不同剪接位点的组合,剪切掉不同的内含子或外显子,将同一基因中的外显子以不同的组合方式产生不同的成熟m RNA分子。不同的m RNA选择性剪接异构体可以进一步翻译成功能不同或互相拮抗的蛋白质,或者在相同的细胞由于表达水平的不同导致不同的表型。不同的选择性剪接变异体在具体的细胞功能活动中可能是相互独立或共同发挥作用。近年研究显示SIRT1存在选择性剪接,如人的SIRT1已经发现两种选择性剪接变异体,分别是缺失第8外显子的SIRT1-△Exon8和缺失第2至第9外显子的SIRT1-△Exon2/9,这两种不同的选择性剪接变异体各自发挥特定的功能,明显区别于SIRT1-FL在细胞中发挥的功能。已知SIRT1广泛分布于大鼠神经系统,而SIRT1的选择性剪接变异体是否也存在于此尚不清楚;如果存在,其选择性剪接变异体的功能是什么以及它是否参与了神经干细胞的分化呢。我们推测大鼠神经系统可能存在SIRT1的选择性剪接变异体,也许正是之前忽略了SIRT1选择性剪接的存在,才导致了SIRT1在神经干细胞分化中矛盾结论的产生,即SIRT1选择性剪接的存在可能为之前有关SIRT1作用的矛盾观点提供一个合理的解释。目前有关SIRT1选择性剪接的研究多数集中在小鼠和人源细胞。大鼠是仅次于小鼠的最常用的实验哺乳动物,已知SIRT1广泛分布于大鼠神经系统,探讨大鼠SIRT1是否存在选择性剪接将为后续研究选择性剪接变异体的生理、病理功能奠定基础。SIRT1基因在哺乳动物高度保守,而由于种属差异,大鼠的SIRT1基因与人类并不完全相同。通过基因比对,我们推测大鼠的SIRT1基因很有可能缺失第7外显子,即产生SIRT1-△Exon7。因此,本研究首先观察大鼠神经系统是否存在SIRT1-△Exon7,其次比较SIRT1的全长(SIRT1-FL)和SIRT1的选择性剪接变异体(SIRT1-△Exon7)在海马(神经干细胞的来源部位)和皮层(成熟神经细胞的富集部位)这两个部位的表达差异,为SIRT1-△Exon7是否参与神经干细胞的分化提供初步的探索;再通过比较SIRT1-FL和SIRT1-△Exon7在神经干细胞分化前后的表达变化和酶活性差异,进一步明确SIRT1-FL和SIRT1-△Exon7在神经干细胞分化过程中的作用。方法:1、PCR检测SIRT1-FL和SIRT1-△Exon7:取新生SD大鼠的大脑组织,分离海马与皮层。提取总RNA,普通反转录PCR检测SIRT1-FL和选择性剪接变异体SIRT1-△Exon7的表达。然后再应用RT-PCR方法分别检测SIRT1-FL和SIRT1-△Exon7在海马与皮层这两个部位的表达。2、神经干细胞培养、鉴定及诱导分化:采用无血清细胞培养法,新生大鼠海马神经干细胞增殖形成悬浮的神经球后,应用免疫荧光技术对神经干细胞进行鉴定,检测其标记性蛋白巢蛋白(Nestin)的表达。再用含有10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基诱导神经干细胞分化,随后分别用神经元特异性的微管相关蛋白β-Tubulin抗体和神经胶质细胞特异性的胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗体行免疫荧光染色,鉴定已经分化的神经元和胶质细胞。3、RT-PCR检测SIRT1-FL和SIRT1-△Exon7:应用RT-PCR方法,检测增殖的神经球和神经球诱导分化后SIRT1-FL和SIRT1-△Exon7的m RNA含量。4、SIRT1酶活性检测:用SIRT1活性检测试剂盒检测神经球分化前后SIRT1去乙酰化酶活性的变化。结果:1、SIRT1-△Exon7和SIRT1-FL的m RNA在大鼠海马和皮层均有表达;2、海马SIRT1-△Exon7的m RNA水平比SIRT1-FL低62.02%(P<0.05),皮层SIRT1-△Exon7的m RNA水平比SIRT1-FL低83.33%(P<0.05);皮层SIRT1-FL m RNA含量比海马高5.81%(P<0.05),而皮层SIRT1-△Exon7的含量比海马低56.68%(P<0.05);3、神经干细胞分化前的SIRT1-△Exon7的m RNA水平比SIRT1-FL低44.12%(P<0.05),分化后SIRT1-△Exon7的m RNA水平比SIRT1-FL低74.62%(P<0.05);神经干细胞分化后的SIRT1-FL m RNA含量较分化前增高30.21%,SIRT1-△Exon7的m RNA含量较分化前降低41.02%(P<0.05);分化后总的SIRT1去乙酰化酶活性较分化前增高30.08%(P<0.05)。结论:1、我们首次发现大鼠神经系统存在SIRT1-△Exon7;2、SIRT1-△Exon7在海马和皮层的表达水平都低于SIRT1-FL,皮层的SIRT1-△Exon7水平低于海马,而皮层的SIRT1-FL水平高于海马,间接提示SIRT1-FL可能促进了神经干细胞的分化过程而SIRT1-△Exon7可能发挥相反的作用;3、SIRT1-△Exon7在神经干细胞分化前后的表达水平都低于SIRT1-FL,分化后的SIRT1-△Exon7水平低于分化前,分化后的SIRT1-FL水平高于分化前,这一结果与海马和皮层的实验结果相一致,进一步明确SIRT1-FL可能促进神经干细胞分化而SIRT1-△Exon7抑制分化。神经干细胞分化后较分化前相比,总的SIRT1去乙酰化酶活性升高水平(30.08%)与SIRT1-FL的m RNA含量的升高水平(30.21%)几乎一致,提示SIRT1-FL可能是通过增高其去乙酰化酶活性而促进神经干细胞的分化;而SIRT1-△Exon7在分化后不但水平下降,且由于其缺失第七外显子而使酶活性也大大降低,因此SIRT1-△Exon7几乎不可能对总的SIRT1酶活性的升高做出贡献,提示SIRT1-△Exon7可能作为独立于SIRT1-FL之外的一个信号分子抑制神经干细胞的分化。