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研究背景与目的1.2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)是最常见的慢性疾病之一,临床表现以胰岛素抵抗性为主,伴有相对胰岛素缺乏。冠心病是指由冠状动脉发生动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)病变所引起的一种心脏病,表现为血管腔的狭窄或阻塞,心肌缺血、缺氧甚至坏死。患有冠心病的糖尿病患者比单纯冠心病患者发生不良心血管事件的风险更高,原因之一是高血糖可引起血脂代谢紊乱,加速AS的发展。胰高血糖素样肽-1(Glucagon-likepeptide-1,GLP-1)类似物利拉鲁肽作为一种临床上治疗糖尿病的药物,除发挥降糖作用外,对调节血脂代谢紊乱也有一定作用。胆固醇逆转运(reverse cholesteroltransport,RCT)是一种重要的心脏保护机制,胆固醇流出减少可导致血脂异常。目前关于利拉鲁肽通过胆固醇逆转运过程发挥作用的研究甚少,本研究旨在探讨利拉鲁肽对高脂饮食db/db小鼠胆固醇逆转运作用的影响及机制。2.动脉粥样硬化是冠心病最常见的病理基础,可由血脂异常、糖尿病等危险因素导致血管内壁的改变及损伤。脂质代谢异常、血管壁上过多脂质的沉积、内皮细胞的增厚和硬化是AS发生的重要原因。二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)是大蒜中挥发性硫化物的有效成分,具有降低胆固醇、改善血脂水平紊乱的作用。目前有关DADS对HepG2细胞脂质代谢影响的研究不多,本研究旨在探讨DADS对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)条件下HepG2细胞脂质代谢的影响,并阐明其相关蛋白表达变化及信号通路。研究方法1.动物实验本实验研究动物使用6周龄雄性C57BL/6小鼠和db/db小鼠,普通饮食适应性喂养1周后,将db/db小鼠随机分为5组(每组12只):野生型+正常饮食(n=12)、db/db+正常饮食(n=12)、db/db+高脂饮食(n=12)、db/db+高脂饮食+利拉鲁肽(n=12)、db/db+高脂饮食+阿托伐他汀(n=12)。皮下注射利拉鲁肽(200μg/kg)或等量生理盐水,每日2次,连续8周,每周测量体重和血糖。治疗8周后,取血进行血脂四项测定,取肝进行苏木精-伊红(HE)染色、油红O染色检测小鼠肝脏病变情况,通过测定腹腔注射3H标记胆固醇后血浆和粪便中的放射性来评估小鼠体内胆固醇流出的情况。同时检测小鼠体内胆固醇逆转运相关基因蛋白ABCA1、ABCG1、SR-B1表达。2.HepG2细胞实验(1)HepG2细胞在含10%FBS、10 g/L青霉素和10g/L链霉素的DMEM培养基中,于37℃,5%CO2的细胞培养箱中培养。显微镜下观察细胞密度,约达到80%-90%融合度后,用无血清的DMEM培养基处理细胞饥饿12h。后用不同浓度的LPS(0、200、500、1000、1500 ng/ml)分别处理细胞24 h,CCK8法检测细胞活性,选取最佳LPS浓度用于后续实验。Real-time PCR检测不同浓度LPS刺激后,细胞内PCSK9、LDLR、SREBP2和HNF1α的mRNA表达。Western blot检测不同浓度LPS刺激后,细胞内PCSK9、LDLR、SREBP2和HNF1α的蛋白表达。(2)将细胞分别在不同浓度DADS(0、20、40、80、160μg/ml)下培养24 h,CCK8法检测细胞活性,Real-time PCR检测不同浓度DADS刺激后,细胞内PCSK9、LDLR、SREBP2 和 HNF1α 的 mRNA 表达。Westernblot 检测不同浓度 DADS 刺激后,细胞内PCSK9、LDLR、SREBP2和HNF1α的蛋白表达。将细胞在LPS(1000 ng/ml)加不同浓度 DADS(0、20、40、80μg/ml)条件下培养,Real-time PCR 和Western blot分别检测相关基因和蛋白的表达,DiL-LDL检测细胞内LDL摄取。(3)在有/无PI3K/Akt抑制剂LY294002条件下,将细胞在LPS(1000 ng/ml)加DADS(80μg/ml)条件下培养,用于信号通路研究实验。(4)研究DADS(80 μg/ml)和阿托伐他汀(5 μmol/L)联合应用对HepG2细胞PCSK9表达的影响。研究结果1.利拉鲁肽促进高脂饮食db/db小鼠胆固醇流出治疗8周后db/db小鼠血脂和病理改变显著,结果如下:(1)普通饮食以及高脂饮食组的db/db小鼠血清TC、TG、LDL-C水平较野生型小鼠均明显升高;病理染色结果显示,肝脏组织出现病理变化,如脂质滴状结构和液泡,内膜中存在有大量的脂质滴,高脂饮食组的db/db小鼠更为显著;3H标记胆固醇检测体内胆固醇流出结果显示,与野生型小鼠相比,普通饮食db/db小鼠及高脂饮食db/db小鼠血清和粪便3H标记胆固醇含量显著降低。肝脏Western blot结果表明,db/db小鼠肝脏ABCA1表达显著降低。(2)与高脂饮食db/db小鼠相比,利拉鲁肽(200μg/kg,每日两次)可显著降低db/db小鼠血清TC、TG和LDL-C水平;改善db/db小鼠肝脏组织中脂肪滴和脂质沉积。3H标记胆固醇检测体内胆固醇流出结果显示,利拉鲁肽(200 μg/kg,每日两次)可增加小鼠血清及粪便3H标记胆固醇含量。肝脏Western blot结果表明,利拉鲁肽可增加db/db小鼠肝脏ABCA1蛋白表达水平。2.DADS通过激活PI3K/Akt-SREBP2信号通路调节PCSK9的表达,促进HepG2细胞摄取LDL(1)LPS可呈浓度依赖性地增加HepG2细胞中PCSK9和SREBP2的表达,进而导致LDLR表达降低。(2)DADS能增加LPS条件下HepG2细胞中LDLR的表达,从而促进HepG2细胞对LDL的摄取,进一步机制研究表明该作用是通过激活PI3K/Akt-SREBP2信号通路发挥作用的,即呈现出剂量依赖性地增加p-AKT蛋白表达。(3)DADS可降低阿托伐他汀引导的HepG2细胞中PCSK9的表达。结论1.利拉鲁肽可通过促进胆固醇逆转运,从而改善高脂饮食db/db小鼠的血脂水平紊乱和肝脏脂质沉积,改变小鼠胆固醇逆转运过程相关蛋白的表达,从而减轻其动脉粥样硬化程度。2.DADS通过PI3K/Akt-SREBP2信号通路抑制HepG2细胞PCSK9表达,减少LDLR降解、有助于LDLR蛋白的稳定,从而增强HepG2细胞对LDL的摄取,为DADS在改善血脂异常和抗动脉粥样硬化方面的研究应用提供可靠的实验依据。