背景:年龄相关性黄斑变性(Age-related Macular Degeneration,AMD),是造成60岁以上老年人视力障碍的主要原因,分为两种类型,一种是干性的(萎缩性),占AMD的85%-90%,是由于视网膜色素上皮细胞(Retinal Pigment Epithelium,RPE)和光感受器细胞缺乏而形成的地图样萎缩(Geographic atrophy,GA)。另外一种是湿性的(新生血管性),是由于脉络膜新生血管(Choroidal neovascularization,CNV)导致出血和渗出进入RPE和视网膜感觉层之间。世界卫生组织表示,AMD已在全球范围内成为失明的主要原因,在白内障和青光眼之后排名第三。近年来,我国AMD患者的发病率呈逐年上升趋势。随着我国人口老龄化问题的加重,AMD患病率将进一步增高,目前大多数受影响的患者还没有特效的治疗方法。抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)玻璃体腔内注射治疗,是目前最有效的抑制新生血管生成和控制血管渗漏的方法,但只有40%的患者能够改善视力。此外,CNV患者对抗VEGF治疗的反应有很大的差异性,而GA尚没有确切有效的治疗方法。这些均在生理、心理、经济、生活质量及社会交往等多方面给患者和家庭造成了巨大负担。目前,研究发现遗传因素、氧化应激损伤因素、免疫因素等被认为是影响AMD发生的主要原因,但是其具体的发病机制尚不完全清楚。眼部及全身的某些基因表达的异常进而引起的生物学分子表达量的异常是否对AMD的发生及病程具有预警作用尚不清楚。既往的研究在寻找与某种疾病相关的基因时,仅关注于某一个或某一些感兴趣的基因,往往导致研究效率低下。但随着“基因组学”方法的应用,涌现的海量数据为我们提供了非常重要的研究平台,极大地提高了搜寻出某种疾病相关基因的效率。通过应用生物信息学技术,我们能够从这些大量数据中发掘出重要的信息,帮助我们阐明疾病的分子机制和发病机制等。基因表达谱学的研究为我们提供了一个全新的机会去研究基因表达的调控,比如在疾病的发病及进展过程中相关基因表达的变化。为进一步研究AMD的分子发病机制,寻找AMD相关的生物标记物,更好地为AMD的诊断、治疗和预防提供科学依据,本实验研究基于生物信息学方法对AMD患者的转录组学数据进行分析,发掘出AMD发病过程中可能发挥重要作用的基因并进行验证,进行相关基因的功能学分析,探讨差异性表达基因在AMD的发生及发展过程中的作用机制,并进一步研究AMD不同临床治疗方案的疗效,以指导临床诊断及治疗。本研究第一部分基于NCBI高通量基因表达数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)中已发表的基因表达谱芯片数据进行整合分析,原始芯片数据来源GEO数据库收录的GSE76237与GSE29801表达谱芯片数据。采用Agilent-014850 Whole Human Genome Microarray 4x44K G4112F表达谱芯片进行检测。本次分析分别从全血单个核细胞表达谱芯片与病变组织样本表达谱芯片两个角度进行数据整合分析,得出差异性表达基因(Differentially expressed genes,DEGs),并进行这些差异性表达基因的功能学分析。本研究第二部分,即是在第一部分的基础上,从基于生物信息学方法对GEO数据库来源的AMD全血单个核细胞样本和病变组织样本基因表达谱数据进行整合分析得出的差异性表达基因中筛选出8个候选差异性表达基因(DEGs)。验证这些候选差异性表达基因在我国AMD患者外周血单个核细胞中的表达:通过实时荧光定量核酸扩增检测技术(qPCR or Real-time PCR),在包含有中国AMD患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的实验组与中国健康人PBMC的对照组样本中,对这些DEGs进行验证,得出差异性表达基因在中国人AMD患者PBMC中的表达特征,并进一步将实验组按照年龄、性别、治疗效果不同进行分组,分别进行实验验证及对比分析研究。本研究的第三部分,对于临床诊断符合入选标准的AMD患者进行抗VEGF药物玻璃体腔注射和光动力疗法(Photodynamic Therapy,PDT)联合抗VEGF药物玻璃体腔注射两种不同方案治疗,治疗前和治疗后1周-6月分别检测术眼最佳矫正视力(Best corrected visual acuity,BCVA)、术眼视力提高的比率、眼部血流动力学改变、黄斑中心凹厚度(central foveal thickness,CFT)及视野参数,比较两种治疗方案疗效的差别,以期找到更加安全有效的AMD治疗方案,为新的AMD治疗方案的制定提供理论依据。第一部分年龄相关性黄斑变性患者与健康人基因表达谱差异分析目的:通过对年龄相关性黄斑变性患者与健康人基因表达谱的差异性分析,得出可能与AMD发病相关的基因,并进行功能学分析。方法:基于NCBI GEO数据库中已发表的基因表达谱芯片数据进行整合分析,原始芯片数据来源GEO数据库收录的GSE76237与GSE29801表达谱芯片数据。其中GSE76237包含14例年龄相关性黄斑变性病人与15例健康正常人的单核细胞,采用Affymetrix Gene1.0 ST芯片进行表达谱分析;GSE29801包含177例年龄相关性黄斑变性患者捐赠者视网膜-脉络膜组织样本与118例没有眼部疾病的捐赠者的视网膜-脉络膜组织样本,采用Agilent-014850 Whole Human Genome Microarray 4x44K G4112F表达谱芯片进行检测。本次分析分别从全血单核细胞表达谱芯片与病变组织样本表达谱芯片两个角度进行数据整合分析,数据分析方法包括:1、芯片数据归一化分析:Bioconductor limma package;2、差异基因分析:Bioconductor limma package;3、GO与KEGG功能富集分析:WEB-based Gene Set Analysis Toolkit;4、绘图:R语言,得出差异性表达基因(Differentially expressed genes,DEGs),并进行这些差异性表达基因的功能学分析。结果:1.通过对AMD患者与健康正常人全血单核细胞表达谱芯片进行生物信息学分析,按照差异倍数大于1.5以及矫正后的p值小于0.05进行差异性基因筛选,总共获得111个差异性表达基因,上调表达基因28个,下调表达基因83个。其中差异倍数大于2倍的差异性表达基因8个,上调表达2个,下调表达6个。2.AMD患者外周血单个核细胞差异表达基因基因本体学(Gene ontology,GO)功能富集分析结果显示,差异性表达基因参与的主要生物学功能包括白细胞活化、淋巴细胞活化、T细胞活化以及T细胞募集等。3.AMD患者外周血单个核细胞差异性表达基因KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析结果显示,差异性表达的基因主要参与造血细胞、T细胞受体通路、Th1 and Th2细胞分化、Th17细胞分化以及原发性免疫缺陷等信号通路。4.通过对AMD捐赠者与健康人捐赠者视网膜-脉络膜组织样本表达谱芯片进行生物信息学分析,按照矫正后的p值小于0.05以及差异倍数大于2倍进行差异基因的筛选,一共获得12个差异表达基因,其中3个上调表达基因,9个下调表达基因。5.AMD患者单核细胞中筛选出的差异倍数大于2倍且矫正后p值小于0.05的显著差异性表达基因与组织样本中筛选出的差异倍数大于2倍且矫正后p值小于0.05的显著差异性表达基因进行分析,绘制veen图,筛选两者共同差异性表达基因,结果发现AMD患者其外周血单个核细胞基因表达谱特征的变化和组织基因表达谱特征的变化并不相同,这可能与AMD的发病激发了全身免疫系统,在单核细胞与病变组织上均有累及,但出现了不同的基因表达有关。结论:1.AMD患者和对照组之间外周血单个核细胞的基因表达谱具有显著差异,提示组织病变可能诱发机体的免疫反应,从而引起单个核细胞表达图谱的变化。但其变化呈现出渐进的趋势,提示衰老可能是参与AMD疾病发生发展的因素之一。2.AMD患者外周血单个核细胞差异性表达基因参与的主要生物学功能包括白细胞的活化、淋巴细胞的活化、T细胞的活化以及募集等,其主要参与的信号通路包括造血细胞、T细胞受体通路、Th1 and Th2细胞分化、Th17细胞分化以及原发性免疫缺陷等,这些均提示差异性表达基因可能与AMD患者的免疫反应密切相关。3.AMD患者其外周血单个核细胞基因表达谱特征的变化和组织基因表达谱特征的变化并不相同,这可能与AMD的发病激发了全身免疫系统,在单核细胞与病变组织上均有累及,但出现了不同的基因表达有关。第二部分年龄相关性黄斑变性转录组研究目的:通过AMD患者与健康人转录组研究,发掘差异性表达基因对AMD发病和预后的影响机制,为寻找新的诊治靶点提供实验依据,为AMD诊断指标及预后指标的研究奠定实验基础。方法:根据本研究第一部分的结果,我们首先从应用生物信息学方法对GEO数据库来源的AMD外周血单个核细胞样本基因表达谱数据进行生信分析得出的差异性表达基因(DEGs)中筛选出8个差异性表达基因(包括TMEM176A、TMEM176B、ZEB2、LEF1、FCMR、MS4A1、CD3G和IL7R)。然后通过实时荧光定量PCR技术(Real-time qPCR),在包含有21例中国AMD患者外周血单个核细胞(PBMC)的实验组与15例中国健康人外周血单个核细胞(PBMC)的对照组样本中,对这些DEGs进行验证,得出差异性表达基因在中国AMD患者PBMC中的表达是否有差异,并进一步将实验组按照年龄、性别、治疗效果不同进行分组,分别进行实验验证及对比研究。结果:1.在这8个候选差异性表达基因中,共3个基因在验证样本中结果与数据挖掘结果相一致,TMEM176A、TMEM176B和ZEB2在AMD外周血单个核细胞(PBMCs)中显著上调表达(P=0.0000,0.0000,0.0000,P<0.001);另外5个候选DEGs在验证样本中的结果与数据挖掘结果并不一致,LEF1、MS4A1、CD3G、FCMR与IL7R在AMD患者PBMCs中表达显著上调(P=0.0000,0.0000,0.0000,0.0000,0.0000,P<0.001)。2.8个候选基因在AMD组不同性别病人PBMCs中的表达水平与健康正常人不同性别中的表达水平相比均存在显著差异,差异均具有统计学意义(P<0.01);TMEM176A、FCMR、CD3G、MS4A1、IL7R、ZEB2与LEF1基因表达水平在女性患者中高于男性患者,但两者之间比较差异无统计学意义(P>0.05);TMEM176B基因在男性患者中高于女性患者,两者之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。这表明,与健康人相比较,8个候选基因表达水平在不同性别的患者外周血PBMCs中均存在显著差异,但与患者的性别无显著相关。3.8个候选基因在AMD组不同年龄患者PBMCs中的表达水平与健康人不同年龄者相比均存在显著差异,差异均具有统计学意义(P<0.05);TMEM176A与TMEM176B基因表达水平在年龄>70岁患者中高于年龄≤70岁患者,但两者之间比较差异无统计学意义(P>0.05);MS4A1基因表达水平在年龄>70岁的患者中明显低于年龄≤70岁的患者中,两者之间比较差异具有统计学意义(P<0.05);LEF1、FCMR、CD3G、IL7R与ZEB2基因表达水平在年龄>70岁患者低于年龄≤70岁患者,但两者之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。这表明,与健康人相比较,8个候选基因表达水平在不同年龄的患者PBMCs中均存在显著差异,MS4A1基因表达水平与患者的年龄显著相关。提示AMD的发生与进展与衰老相关。4.8个候选基因表达水平在疗效差患者中均高于疗效好的患者,但差异无统计学意义(P>0.05)。这表明疗效不同的AMD患者其外周血单个核细胞基因表达虽存在差异,但差异并不显著。提示我们需要进一步扩大样本量来验证这些基因能否用于AMD预后的评估指标。结论:1.TMEM176A、TMEM176B、ZEB2、LEF1、FCMR、MS4A1、CD3G和IL7R在AMD患者外周血单个核细胞中存在显著差异性表达。这些差异表达基因其功能主要涉及膜受体及相关的信号传导,其编码的蛋白主要分布在细胞膜外侧,其参与的生物学过程主要涉及免疫反应及免疫细胞的分化。这些均提示AMD的发生发展与全身免疫反应密切相关。2.候选基因表达水平在不同性别的患者外周血PBMCs中与健康人比较均存在显著差异,但与患者的性别无显著相关。提示AMD的发生进展无明显性别差异。3.候选基因表达水平在不同年龄的患者外周血PBMCs中与健康人比较均存在显著差异,其中MS4A1基因表达水平与患者的年龄有显著相关性。提示AMD的发生进展与衰老密切相关。4.这些差异性表达基因有可能是非常有前景的AMD诊断和预后的靶标或生物标记物。第三部分抗VEGF药物玻璃体腔注射联合PDT治疗年龄相关性黄斑变性的疗效研究目的:寻找更加安全有效的AMD治疗方案,为新的AMD治疗方案的制定提供理论依据。方法:按照入选标准及排除标准选择2013年1月—2016年1月期间在郑州大学第一附属医院被诊断为年龄相关性黄斑变性的96例(192只眼睛)患者。按照治疗方案,患者被随机分成观察组和对照组,每组48例(96只眼睛)。对照组患者进行抗VEGF药物治疗,玻璃体腔注射0.5 mg/0.05 ml雷珠单抗,根据3+prn治疗方案,每月注射一次,连续注射3次后根据病情需要再追加注射。观察组患者进行抗VEGF药物联合PDT治疗方法,PDT治疗按照年龄相关性黄斑变性的多中心PDT治疗研究(Treatment of age-related macular degeneration with photodynamic therapy,TAP)的方法进行,维替泊芬用量为TAP方法计算量6mg/m~2,激波长689nm,光辐照度600 mw/cm2,能量50 J/cm2,照射时间83 S。在PDT治疗后3天内行玻璃体腔注射0.5 mg/0.05 ml雷珠单抗。治疗前和治疗后1周-6月分别检测最佳矫正视力、眼部血流动力学改变、黄斑中心凹厚度(CFT)及视野参数。采用SPSS 23.0统计软件分析本研究的数据。结果:1.治疗后两组患者最佳矫正视力均缓慢上升。术后1周-6个月内,观察组患者最佳矫正视力明显高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);观察组患者视力提高的比例高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.治疗后6个月内彩色多普勒超声检查显示,观察组患者睫状后短动脉(PCA)的最大收缩期血流速度(PSV)和舒张末期血流速度(EDV)值高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);观察组患者动脉阻力指数(RI)和脉动指数(PI)值低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。3.治疗后6个月内,观察组患者黄斑中心凹厚度(CFT)值低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);观察组患者的视野参数10?和4?平均敏感度(MS)值高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);观察组患者的视野平均缺损(MD)绝对值低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.抗VEGF药物联合PDT疗法能够明显提高治疗后最佳矫正视力,治疗后提高视力的比率明显增高,治疗AMD效果明显。2.抗VEGF药物联合PDT疗法能够改善PCA血流动力学参数,血液供应改善能减轻黄斑中心的水肿,降低中心凹厚度(CFT)值,减少视野缺损,具有较高的临床应用价值。3.抗VEGF药物联合PDT疗法在抑制新血管形成和保护视力的前提下,玻璃体腔注射次数减少,眼部并发症的发生几率降低,但联合治疗方案是否能减少行再次雷珠单抗玻璃体腔注射治疗(IVR)的次数尚不能完全定论,有待于进一步的研究。