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动物毒素是由酶和毒素等组成的复杂的混合物,有很高的医药价值。几千年来我国就已用某些动物毒素治病。随着生物化学和分子生物学的发展,现今已有100多种动物毒素及其组分用于治疗多种疑难病症,用做研究各种生物学现象的工具,涉及到生物学的各个领域,如细胞学、遗传学、免疫学、药理学、血液化学和神经生理学等。本文应用生物化学和分子生物学的手段,对眼镜王蛇蛇毒中的两类小分子活性物质的结构和功能进行了深入的研究。
首先,对α-神经毒的结构和功能的研究。我们成功构建了眼镜王蛇蛇毒毒腺的cDNA文库,在世界上第一次报道了α-神经毒cDNA的13个全序列及3个较完整的部分序列。通过三步分离纯化步骤:Sephadex G-50 分子筛层析、Resource S柱离子交换层析和高效液相色谱的反相柱层析,成功分离纯化到了六个全新的神经毒,通过蛋白质N-末端序列测定和cDNA克隆工作确定了它们的全序列;并对它们的急性毒理毒性进行了初步的研究。这些新的神经毒的发现对于阐明神经毒及其受体间作用机制具有重要意义。生物化学和分子生物学的研究表明,眼镜王蛇的神经毒是眼镜王蛇蛇毒毒素的主要组成成分,在mRNA水平和蛋白质水平上都有很高的多样性。这对揭示蛇毒中多基因家族的进化发展有重要意义。
其次,对Kunitz-BPTI丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究。从眼镜王蛇初毒中,通过Sephadex G-50 分子筛层析、亲和层析和高效液相反相柱层析三步,分离纯化到了一种全新的具有对胰蛋白酶和糜蛋白酶双重抑制功能的蛋白质——Kunitz-BPTI丝氨酸蛋白酶抑制剂OH-TCI。还原和非还原的SDS-PAGE电泳上显示该蛋白质是单一肽链,基质辅助激光解吸飞行时间质谱确定了该蛋白质是分子量为6339。通过测定了OH-TCI的N-末端的20个氨基酸残基为“GRPKFCELPAVSGFCKAYIP”;cDNA克隆工作确定了该蛋白质的全序列。从构建的眼镜王蛇蛇毒毒腺的cDNA文库中筛选到编码OH-TCI克隆。重组的OH-TCI被转化到大肠杆菌DH5α中,成功表达出具有天然活性的重组蛋白;表达蛋白的分子量经MALDI-TOF-MS测定与天然蛋白质相同。通过分子生物学的定点突变法,构建了OH-TCI的六个突变体,并一一在大肠杆菌中得到了成功表达。