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目的:1.比较分析不同分化程度的胃癌细胞株和正常胃黏膜上皮细胞株中CYP2E1的表达差异,探索CYP2E1在胃癌中的激活情况,寻找胃癌的生物学标志物。2.构建稳定过表达CYP2E1的胃癌细胞株,探索CYP2E1对胃癌细胞的增殖、周期、凋亡、侵袭、迁移等生物学功能的影响。3.观察在稳定过表达CYP2E1的胃癌细胞株中PI3K/Akt/mTOR信号通路关键基因的变化,探讨CYP2E1对PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响及CYP2E1调控胃癌细胞生长的分子机制。4.观察PI3K抑制剂LY294002、mTOR抑制剂Rapamycin对胃癌细胞株中的CYP2E1蛋白表达的影响,对CYP2E1与PI3K/Akt/mTOR信号通路在胃癌中的相互作用机制提出科学假设,探讨PI3K/Akt/mTOR通路在胃癌中调控CYP2E1的可能分子机制,为该通路特异性抑制剂应用于开发新的治疗药物提供更多的实验依据。方法:1.体外培养不同分化程度的MGC-803胃癌细胞株、SGC-7901胃癌细胞株、BGC-823胃癌细胞株以及正常胃黏膜上皮GES-1细胞株,采用RT-qPCR测定CYP2E1mRNA表达;Western Blot法检测CYP2E1的蛋白表达。2.稳定过表达CYP2E1的MGC-803胃癌细胞株的构建与验证过表达CYP2E1的慢病毒载体及其相应的慢病毒空载载体由上海吉凯基因公司完成构建。设置不经处理的MGC-803细胞组作为空白对照,构建慢病毒载体介导的稳定过表达CYP2E1的MGC-803胃癌细胞组及转染对应的慢病毒空载体MGC-803细胞组。CYP2E1慢病毒载体和慢病毒空载体分别转染MGC-803胃癌细胞株后,定时观察绿色荧光的发生情况。经嘌呤霉素筛选后进行扩大培养,分别提取MGC-803胃癌细胞组（空白对照组）、MGC-803 NC细胞组（转染慢病毒空载体的MGC-803胃癌细胞组）和MGC-803 CYP2E1细胞组（稳定过表达CYP2E1的MGC-803胃癌细胞组）的总RNA,采用RT-qPCR法从mRNA水平对构建稳定过表达CYP2E1的MGC-803胃癌细胞株组进行验证,采用Western Blot法从蛋白水平对构建稳定过表达CYP2E1的MGC-803胃癌细胞组进行验证。3.探索CYP2E1对MGC-803胃癌细胞株的细胞功能学的影响以MGC-803 CYP2E1细胞组为实验组,以MGC-803 NC细胞组作为对照组。采用CCK-8法检验不同时间梯度稳定过表达CYP2E1的MGC-803胃癌细胞的增殖能力,绘制生长曲线;结合流式细胞术检测经Annexin V-APC/PI染色的稳定过表达CYP2E1的MGC-803胃癌细胞的凋亡率变化;以流式细胞仪测定稳定过表达CYP2E1的MGC-803胃癌细胞株的周期改变;收集MGC-803 CYP2E1细胞组细胞种入Transwell上室,检测稳定过表达CYP2E1胃癌细胞侵袭、迁移能力。4.RT-qPCR技术测定稳定过表达CYP2E1的MGC-803胃癌细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路中PI3K、Akt、mTOR的mRNA表达;Western Blot法检测稳定过表达CYP2E1的MGC-803胃癌细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路各总蛋白PI3K、Akt、mTORSer2448和p-PI3K、p-Akt、p-mTORSer2448、p-P70S6KThr389、p-P70S6KSer371、p-4EBP1和ACTIN的表达。5.根据PI3K抑制剂LY294002抑制胃癌细胞增殖的CCK-8实验结果,选取3个药物浓度点应用LY294002处理MGC-803、SGC-7901胃癌细胞株。Western Blot检测LY294002对胃癌细胞中的CYP2E1的蛋白表达的影响。6.根据mTOR抑制剂Rapamycin抑制胃癌细胞增殖的CCK-8实验结果,选取3个药物浓度点应用Rapamycin处理MGC-803、SGC-7901胃癌细胞株。应用Western Blot检测Rapamycin对胃癌细胞株中的CYP2E1的蛋白表达的影响。结果:1.正常胃黏膜上皮细胞GES-1细胞中的CYP2E1 mRNA表达水平显著高于胃癌细胞MGC-803、SGC-7901、BGC-823,差别具有显著性（P<0.05）。胃癌细胞株SGC-7901、BGC-823中CYP2E1的蛋白表达高于正常胃粘膜上皮细胞GES-1。胃癌细胞MGC-803和正常胃粘膜上皮细胞GES-1两组间CYP2E1蛋白表达的无差异。2.成功筛选出稳定过表达CYP2E1的MGC-803胃癌细胞株,并从mRNA和蛋白水平证明构建成功:经RT-qPCR验证,MGC-803细胞组与MGC-803 NC细胞组的CYP2E1 mRNA表达相比差异不具有显著性（P>0.05）;MGC-803 CYP2E1细胞组的CYP2E1 mRNA表达显著高于MGC-803细胞组（P<0.05）、MGC-803 NC细胞组（P<0.05）,高达82.215倍（P<0.05）。与胃癌MGC-803细胞组和MGC-803 NC细胞组相比,MGC-803 CYP2E1细胞组中CYP2E1表达升高。3.CYP2E1在胃癌中呈现促进细胞增殖;抑制细胞凋亡;改变细胞周期;增强胃癌细胞侵袭、迁移恶性行为能力:CCK-8法测绘生长曲线,结果显示不同时间点MGC-803 CYP2E1细胞组增殖率均高于MGC-803 NC组,差异具有显著性（P<0.05）。Annexin V-APC/PI染色结合流式细胞术检测显示MGC-803 NC组的凋亡率显著高于MGC-803 CYP2E1组（P<0.05）。使用流式细胞仪检测细胞的周期分布特征,结果显示MGC-803 CYP2E1组的细胞周期分布处于G0/G1期的细胞比例增多（P<0.05）,在G2/M期的细胞比例下降（P<0.05）,细胞周期分布在S期有略微下降趋势,但差异不具有显著性（P>0.05）。Transwell法检测CYP2E1过表达后细胞迁移能力,结果显示MGC-803 CYP2E1组细胞迁移数均较MGC-803 NC细胞组显著增加（P<0.05）。Transwell法检测CYP2E1过表达后细胞侵袭能力,结果显示MGC-803 CYP2E1组细胞侵袭数均较MGC-803 NC细胞组显著增加（P<0.05）。4.在稳定过表达CYP2E1的MGC-803胃癌细胞中,RT-qPCR检测结果显示,MGC-803 CYP2E1细胞组的PI3K、Akt基因的mRNA表达量与对照组MGC-803 NC细胞组差异不具有显著性（P>0.05）。MGC-803 CYP2E1细胞组的mTOR基因的mRNA表达量较对照组MGC-803组增多,差异具有显著性（P<0.05）。Western blot显示与对照组MGC-803 NC细胞组相比,MGC-803 CYP2E1细胞组PI3K、p-Akt、p-mTOR、p-P70S6KSer371的蛋白表达量均升高;p-PI3K、Akt、mTOR、p-P70S6KThr389的蛋白表达量均不变;p-4EBP1的蛋白表达量下降。5.Western blot检测胃癌细胞MGC-803,结果显示与对照组相比,12.5μmol/L、50μmol/L浓度组中CYP2E1表达低于对照组。6.Western blot检测胃癌细胞SGC-7901,与对照组相比,PI3K抑制剂LY294002的12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L浓度组中CYP2E1的蛋白表达低于对照组。7.Western blot检测胃癌细胞MGC-803、SGC-7901中,与各自对照组相比,mTOR抑制剂Rapamycin的各浓度组中CYP2E1表达不变。结论:1.CYP2E1在胃癌细胞中转录水平低,处于异常失活状态,可能为胃癌的分子标志物。CYP2E1在胃癌细胞中存在转录与翻译水平不一致,存在转录后调控。2.CYP2E1能够增加胃癌的恶性倾向,促进胃癌细胞增殖、减少凋亡、改变细胞周期、增强侵袭、增强迁移,CYP2E1是促进胃癌发生、发展的关键基因。3.CYP2E1可能与PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。CYP2E1在PI3K/Akt/mTOR信号通路中可能处于PI3K下游,可以通过PI3K抑制剂LY294002调控CYP2E1表达。CYP2E1处于Akt和mTOR上游,通过调控Akt和mTOR的磷酸化调控PI3K/Akt/mTOR下游靶点P70S6KSer371和4EBP1的蛋白活化,从而影响胃癌细胞的增殖、周期、凋亡、侵袭、迁移能力。