猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的猪的一种以严重水样腹泻、呕吐和脱水为主要临床特征的急性高度接触性肠道传染病。近几年，我国的许多地区相继出现了 PEDV 的变异毒株，使 PED 的防治难度大大增加了，造成该病不断大规模流行。且河南省不断有 PED 的暴发和流行，鉴于此，本研究对河南省 PEDV 的分子流行病学进行调查，并对 S 基因部分序列及M 基因进行遗传及变异性分析，以了解河南省 PEDV 分子流行状况及基因的遗传变异特点，为河南省PED的诊断及防治提供理论依据。　　PEDV S 基因是诱导机体产生中和抗体的主要保护性抗原基因，减毒沙门菌作为疫苗载体具有可以有效递呈抗原，激发诱导抗沙门菌和外源抗原的全身免疫和黏膜免疫的优点。本研究采用 asd+宿主-载体平衡致死系统，将 S438-771 aa基因克隆至无抗性表达载体 pYA 中，并电转化至减毒猪霍乱沙门菌，成功构建了表达 S 蛋白的重组减毒沙门菌候选疫苗，对其生物学及免疫学特性进行研究，为进一步开发为PEDV基因工程疫苗奠定基础。　　1. 河南省PEDV分子流行病学调查及S、M基因的遗传变异分析　　对采集自河南省不同地区的 38 个规模化养猪场疑似病毒性腹泻 168 份病料进行RT-PCR检测，结果显示有31个猪场的 112份病料显示PEDV阳性，阳性率为66.67 %，猪场阳性率为81.58%。选取13株PEDV代表株间S基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列同源性分别为97.0 %~99.9 %和95.9 %~100.0 %，与经典毒株CV777同源性分别为94.9 %~96.0 %和93.6 %~95.3 %，与GenBank上登录 PEDV 参考毒株同源性分别为 92.0 %~99.6 %和 89.8 %~99.7 %。13 株PEDV 间 M 基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性为 98.2 %~99.9 %和96.0%~99.6%，与经典毒株CV777同源性为97.2%~98.2%和96.0%~98.2%，与PEDV参考毒株同源性分别为93.5 %~99.6 %和91.2 %~99.1 %。遗传进化分析，显示13株PEDV毒株与中国疫苗株CV777处于不同的分群中，与2016年中国福建省 PEDV 流行株 XM1-2 处于同一分支上，表明河南省流行毒株与中国疫苗株亲缘关系较远。　　2. 携带PEDV S蛋白的原核表达载体的构建及鉴定　　利用RT-PCR技术扩增S基因，并克隆至pMD19-T，构建重组质粒pMD19-T-S，经 PCR、双酶切及测序鉴定正确后，将目的基因片段 S 连接至表达载体pET32a，转化至大肠杆菌 Rosetta 菌株中进行诱导表达，SDS-PAGE 及 Western blotting鉴定结果显示，S蛋白在Rosetta菌株中成功表达，大小为54 kDa，并能够被his单抗识别，具有良好的免疫反应性。　　3. 减毒重组猪霍乱沙门菌C78-1Δcrp?cya?asd(pYA-S)的构建及生物学特性分析　　将S基因连接至原核表达载体pYA中，并将重组质粒pYA-S电转化至减毒猪 霍 乱 沙 门 菌 C78-1Δcrp?cya?asd 中 ， 获 得 减 毒 重 组 菌 C78-1Δcrp?cya?asd(pYA-S)，并分析其生物学特性。结果显示：重组菌可稳定分泌表达具有生物学活性的 S 蛋白，与野生株 C78-1 相比，重组菌失去了利用麦芽糖、甘露醇、山梨醇、鼠李糖及木糖等的能力，生长速度减慢，且可以稳定遗传重组质粒pYA-S，毒力明显降低。　　4. 减毒重组菌C78-1Δcrp?cya?asd(pYA-S)免疫学特性的初步研究　　将重组菌 C78-1Δcrp?cya?asd(pYA-S)口服免疫小鼠，首免 1 周后加强免疫一次，并同时设 C78-1Δcrp?cya?asd(pYA)和 PBS 对照组。首次免疫后第 7 d、14 d、21 d、28 d、35 d，分别从各试验组随机选取5只小鼠，摘眼球采血，分离血清进行进行间接ELISA检测PEDV S抗体水平，并同时检测消化道sIgA抗体水平。并于首次免疫后7 d、14 d、28 d，采集小鼠脾脏，使用MTT法测定淋巴细胞增殖活性，并计算出刺激指数(SI)。结果显示，重组菌 C78-1Δcrp?cya?asd(pYA-S)免疫组首免第 7 d，小鼠体内便可检测到 PEDV S 特异性抗体，随后逐渐上升，到免疫后28 d时，PEDV S抗体水平达到最高，与空载体对照和 PBS 对照形成显著性差异(P<0.01)；消化道 sIgA 抗体水平检测结果显示，重组菌 C78-1Δcrp?cya?asd(pYA-S)、C78-1Δcrp?cya?asd(pYA)免疫小鼠后，均可以刺激产生 sIgA 抗体，并且抗体浓度都在免疫后 21 d 达到最高。此外，重组菌 C78-1Δcrp?cya?asd(pYA-S)与空载体菌 C78-1Δcrp?cya?asd(pYA)相比，差异不显著，但与 PBS 对照组之间差异显著；淋巴细胞增殖试验结果表明重组菌能够刺激外周血淋巴细胞的分化增殖。以上结果表明，重组菌口服免疫小鼠后，能够诱导小鼠机体产生黏膜、体液免疫应答，为进一步开发为 PEDV 基因工程疫苗奠定基础。