肠三叶因子对小鼠炎症性肠病保护作用机制的研究前言炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)为一类病因尚未完全明确的累及胃肠道的慢性非特异性炎症,一般指克罗恩病(Crohn disease,CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)。IBD首次发作可见于任何年龄,但20岁以下溃疡性结肠炎和克罗恩病患儿占炎症性肠病总数的25%-30%。近十几年的研究发现,IBD在我国的发病率也逐年增高,约为0.32/100000。因此,IBD在我国也是一种较常见的消化系统疾病。IBD的肠道炎症和黏膜组织损伤是其主要特征。炎症性肠病的病因和发病机制不明确,目前研究认为IBD是由基因的易感性,环境因素激发和肠道免疫系统失调等多种因素交互作用引起的消化系统自身免疫性慢性炎症疾病。IBD的免疫学发病机制被认为是感染、毒素及药物等作为始动因素破坏肠上皮屏障,使肠组织暴露于大量抗原中,诱发遗传易感宿主的粘膜免疫反应。在IBD肠道炎症和粘膜免疫损伤的发生发展中各种炎症细胞及细胞因子(如TNF-α)、粘附分子、炎症介质等活性分子起着重要作用,它们参与粘膜炎症的多种免疫反应,并作为免疫调节的中心环节,在IBD中的作用为越来越多的研究所证明。通过特异性阻断这些炎症细胞和活性分子的产生、调控以及作用,下调免疫应答的强度,从而控制炎症、持续缓解病情已被视为研究热点。TLR(Toll-like receptor,TLR)是近年发现的一种免疫受体,能识别病原微生物及其细胞壁上的一些保守成分——病原相关分子模式(Pathogen-associatedmolecular pattern,PAMP),对肠黏膜天然免疫反应调节发挥关键作用。IBD患者结肠粘膜上皮细胞及固有层细胞TLR4大量表达,激活下游的细胞因子信号转导,募集炎性细胞,释放自由基,损伤黏膜,激发先天性免疫反应。炎症性肠病(IBD)的病理表现在于肠道粘膜糜烂或溃疡形成,上皮细胞广泛的缺失和固有层内的炎症细胞浸润改变。关于IBD病理机制目前虽不完全清楚,但一般认为IBD的发生与上皮细胞破坏和凋亡加速、炎性细胞凋亡减慢有着密切关系。细胞凋亡失调可以导致自身免疫性疾病的发生。越来越多的证据显示细胞凋亡失调对炎症性肠病(IBD)的组织损伤和免疫功能紊乱有着重要的影响。肠三叶因子(ITF)属于三叶肽家族,是一种新型的生长因子类多肽物质,具有重要的胃肠道黏膜保护和修复作用。实验证明ITF在维持肠上皮细胞的完整性,恢复肠粘膜的正常通透性方面起到重要作用。但现在很多证据把TFFs,特别是ITF与免疫调节联系在一起。更有实验证实ITF可以调节坏死性小肠结肠炎幼鼠模型的免疫反应。近年来的实验也证实ITF在调节细胞凋亡方面也具有一定作用,这意味着ITF在IBD的治疗上可能具有更多的价值。但外源性给予基因重组ITF是否可以对IBD模型小鼠起到保护作用?其机制是否与免疫调节和细胞凋亡干预有关?这些问题的回答也为临床应用ITF治疗IBD提供理论依据。实验材料及方法一、动物模型及分组健康6-8周龄雌性BALB/C小鼠,重量20-26克,由中国医科大学医学实验动物中心提供。随机分为3组,每组16只(保证每组小鼠每个时间点取材时8只以上)。根据灌肠药物及腹腔注射药物的不同将BALB/C小鼠分为3组:A组:三硝基苯磺酸(TNBS)组(直肠灌注5%TNBS 0.10ml/只+50%乙醇溶液0.10ml/只+灌肠后第2天起腹腔注射生理盐水0.1ml/只,连续5天);B组:肠三叶因子(ITF)组(直肠灌注5%TNBS 0.10ml/只+50%乙醇溶液0.10ml/只+灌肠后第2天起腹腔注射ITF0.1ml/只,连续5天);C组:乙醇对照组(直肠灌注50%乙醇溶液0.20ml/只+灌肠后第2天起腹腔注射肠生理盐水0.1ml/只,连续5天);灌肠后第7、14天断头处死动物,留取脾及结肠标本。实验过程中死亡动物不列入本研究。二、实验标本采集及处理造模后每天观察动物一般状况、粪便情况及称量体重;在造模后的第7天和第14天收集粪便测定大便隐血分数,进行疾病活动度指数(DAI)评分。同时给予10%水合氯醛0.3ml/kg腹腔注射麻醉,处死,按以下方法处理和保存标本:1、留取距肛门4cm左右的结肠组织约0.5cm,分别经4%多聚甲醛溶液和2.5%戊二醛溶液固定,分别行H-E染色病理组织学计分、免疫组化、原位末端标记法(TUNEL)凋亡检测和透射电镜观察。2、取结肠病变部位组织用滤纸吸干水分,称重,制成组织匀浆,测结肠组织髓过氧化物酶(MPO)活性;3、留取结肠组织0.5-1cm,置于去RNA酶的Eppendorf管中,经液氮后转至-70℃冰箱,用于进行Real time quantitative RT-PCR、Western blot研究。4、取结肠组织0.5-1cm,经液氮后转至-70℃冰箱中,用于Western印迹实验。5、留取小鼠脾及肠系膜淋巴结淋巴细胞用于流式细胞仪检测。三、试验方法及检测指标1、动态观察小鼠一般状态、体重和排便情况。2、病理形态学研究(1)各组动物于各时间点处死后,剖开腹腔,观察肠管颜色、有无水肿、出血、扩张、透壁溃疡及粘连。(2)光镜观察:结肠组织常规固定后,H-E染色,光镜下观察结肠组织形态学改变。(3)电镜观察:结肠组织固定后,常规作透射电镜观察结肠组织超微结构和肠绒毛的变化。3、组织化学方法检测结肠组织MPO的含量。4、免疫组化法检测结肠组织TNF-α、TLR4、NF-κBp65蛋白的表达。5、TUNEL检测结肠上皮细胞凋亡。6、Real time quantitive RT-PCR法检测结肠组织TLR4、NF-κBP65、Bcl-2及Bax mRNA表达。7、Western Blotting法测定肠组织TLE4和NF-κBP65蛋白表达。8、流式细胞术检测脾及肠系膜淋巴结细胞的凋亡情况及Fas、Bcl-2表达。四、统计学分析计量资料结果以均值±标准差((?)±S)表示,差异比较用SPSS13.0统计软件进行分析,组间比较采用t检验法及制作统计图,P＜0.05提示有显著性差异。结果一、小鼠的一般情况TNBS组小鼠在灌肠后1天出现精神萎靡、厌食、懒动、体毛凌乱、少光泽、粘液便、肉眼血便等症状,化验便潜血+～++++。严重者抽搐、周身凉、甚至死亡。存活者体重于灌肠后第2天下降最明显,第7天时体重平均下降8.19%,第14天时体重基本接近直肠灌注前;ITF组小鼠出现上述症状较TNBS组晚,症状轻,第7天时体重平均下降1.74%,第14天时体重基本接近直肠灌注前或略有增加;50%乙醇对照组小鼠活泼,进食好,体重增加明显,无死亡。二、小鼠结肠病理学变化(一)组织肉眼观察TNBS组结肠末端病变为主,肠道病理改变可涉及全结肠甚至小肠,肠壁和腹膜或大网膜之间粘连;重症小鼠近肛门4cm内出现严重的坏死,未见穿孔;第7天症状严重,第14天好转。ITF组症状较TNBS组轻。50%乙醇对照组结肠周围解剖结构清楚,肠壁薄且光滑,组织病理学显示上皮完整,各层结构清晰。(二)光镜下病理变化观察对照组结肠腺体排列整齐,隐窝、上皮完整,固有层少许淋巴细胞,无炎性细胞浸润。TNBS灌肠第7天可见粘膜充血、出血、糜烂,粘膜层、粘膜下层中性粒细胞及其它炎性细胞浸润。病变严重小鼠肠壁全层弥漫性充血、出血,非局限性透壁性坏死,肠上皮细胞坏死脱落,甚至全层坏死脱落。损伤部位四周黏膜腺体排列不齐或破坏,杯状细胞减少、消失,肠壁水肿;ITF组结肠黏膜损伤减轻,炎细胞浸润减弱,水肿减轻,溃疡表浅轻微。TNBS造模后14天,与造模后7天相比溃疡多为局部改变,非透壁性的,炎细胞浸润程度减轻,水肿存在,杯状细胞减少或消失,ITF组与TNBS组相比无显著性差异。(三)肠组织在电镜下变化50%乙醇对照组上皮细胞柱状,核呈卵圆形,顶部微绒毛排列整齐,细胞间紧密连接完整,内质网及线粒体清晰;TNBS/乙醇作用下顶部微绒毛疏松,水肿,微绒毛排列不整、部分断裂、缺失,部分紧密连接增宽或断裂。部分柱状上皮细胞变形、缺失,细胞核固缩,染色质边聚。粘膜下层有大量炎症细胞浸润,线粒体等细胞器空泡变性改变。TNBS/乙醇作用后7天细胞损伤严重,至14天细胞损伤有所恢复。ITF作用的肠组织病变轻微。(四)小鼠DAI记分TNBS组小鼠在7天、14天平均DAI评分明显高于50%乙醇对照组小鼠(p＜0.01)。ITF组第7天DAI评分明显低于TNBS组(p＜0.05);第14天DAI评分,与TNBS组差别非常显著(p＜0.01)。三、小鼠结肠组织MPO检测造模后7天、14天,TNBS组小鼠结肠MPO活性与50%乙醇对照组相比有显著增加(p＜0.01)。ITF组MPO含量与TNBS组相比均显著降低(p＜0.05)。四、小鼠结肠上皮凋亡的变化7天TNBS组结肠上皮细胞凋亡阳性细胞较多,主要集中在肠绒毛端,14天有所下降,凋亡指数明显高于乙醇对照组(p＜0.01);ITF组凋亡指数较TNBS组明显下降,差异显著,7天(p＜0.01),14天(p＜0.05);对照组则凋亡很少。五、小鼠脾及肠系膜淋巴结淋巴细胞凋亡及其调控蛋白情况TNBS组、ITF组脾及肠系膜淋巴结淋巴细胞凋亡数量较乙醇对照组明显下降,且有统计学意义(p＜0.01),而TNBS组与ITF组之间无显著性差异。TNBS组在第7天脾及肠系膜淋巴结淋巴细胞中表达Fas的细胞数量显著下降,在第14天数量有所上升,但仍低于对照组,有统计学差异(p＜0.05)。ITF组与TNBS组之间无统计学差异。而表达Bcl-2的细胞数量则在三组之间无显著性差异。六、小鼠结肠组织TNF-α、TLR4和NF-κBp65蛋白的表达变化(一)免疫组化显示7天标本见TNF-α、TLR4、NF-κBp65蛋白在TNBS组、ITF组蛋白表达明显增强,较乙醇对照组有显著的差异(p＜0.01),ITF组蛋白表达较TNBS组降低,差异显著(p＜0.01)。14天标本见TNF-α、TLR4、NF-κBp65蛋白在TNBS组、ITF组蛋白表达明显增强,较乙醇对照组有显著的差异(p＜0.05),ITF组蛋白表达较TNBS组降低,差异显著(p＜0.05)。(二)Western Blot检测肠组织TLR4和NF-κBP65蛋白显示TLR4蛋白在乙醇组有一定的表达,TNBS组表达明显增强,ITF组表达明显弱于TNBS组,差异均显著(P＜0.01)。NF-κBP65在乙醇组表达较弱,在TNBS组明显增强,ITF组表达明显弱于TNBS组,差异显著(P＜0.01)。七、小鼠结肠组织TLR4、NF-κBp65、Bcl-2和Bax的分子生物学变化TNBS组、ITF组与乙醇对照组比较TLR4和NF-κBp65的基因表达水平均有升高,两者变化趋势一致;基因水平在第7天即有升高,到第14天有所恢复,但较对照组仍有显著差异(p＜0.01)。在第7天、14天ITF组的TLR4和NF-κBp65基因表达均较TNBS组有所下调,差异显著(p＜0.01)。TNBS组、ITF组与乙醇对照组比较Bcl-2的基因表达水平均有降低,而Bax的基因表达水平均有升高,两者变化趋势相反;Bcl-2基因水平在第7天下降明显,到第14天有所恢复,但较对照组仍有显著差异(p＜0.01)。Bax基因水平在第7天即有升高,到第14天有所恢复,但较对照组仍有显著差异(p＜0.01)。在第7天、14天ITF组的Bcl-2基因表达均较TNBS组有所升高,差异显著(p＜0.01);而Bax基因表达均较TNBS组有所下降,差异显著(p＜0.01)。结论1、ITF可以减轻TNBS诱导的小鼠炎症性肠病肠粘膜炎症病理损伤并能促进损伤的修复。2、针对由TNBS诱导的小鼠炎症性肠病腹腔注射ITF是一个方便而且有效的实验研究方法。3、TNBS诱导的IBD小鼠结肠粘膜组织中TLR4/NF-κBp65的mRNA及蛋白表达上调,TNF-α高表达。4、腹腔注射ITF对小鼠炎症性肠病结肠组织损伤的保护作用机制之一可能是与下调结肠粘膜组织中TLR4/NF-κBp65的mRNA及蛋白表达量而降低TNF-α的表达有关。5、TNBS诱导的IBD小鼠结肠粘膜上皮存在凋亡过度,可能与Bcl-2 mRNA表达下调,Bax mRNA表达上调,Bcl-2/Bax的比值下降有关。6、ITF具有下调TNBS诱导的IBD小鼠结肠粘膜上皮凋亡的作用,可能是通过上调Bcl-2 mRNA表达,下调Bax mRNA表达,增加Bcl-2/Bax的比值实现的。7、INBS诱导的IBD小鼠脾淋巴细胞和肠系膜淋巴结淋巴细胞存在凋亡不足,可能与Fas/FasL信号传导通路有关。8、ITF对TNBS诱导的IBD小鼠脾淋巴细胞和肠系膜淋巴结淋巴细胞的凋亡可能无调节作用。