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目的:急性肺损伤(acute lung injury, ALI)和急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是指心源性以外各种肺内外致病因素(严重感染、创伤、休克等)导致的急性、进行性、顽固性呼吸衰竭。脓毒症(sepsis)是ALI/ARDS最主要的致病因素,ALI/ARDS是全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)在肺脏发生发展的恶化。ARDS的一个标志就是肺泡上皮细胞细胞外基质(extracellar matrix, ECM)的破坏,最近的研究表明,基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs)能够降解ECM,可能促进了急性肺损伤的发展。MMP-9属于MMPs家族中的一种,被称为Ⅳ型胶原酶(也称明胶酶B),能够降解基底膜成分,包括Ⅳ型胶原,纤维结合素和明胶。MMP-9活性的升高能够大量的降解肺泡上皮细胞外基质,引起急性肺损伤的发生。乌司他丁是从人尿中提取出来的一种蛋白酶抑制剂,具有抑制白细胞聚集、抑制白细胞释放蛋白酶、稳定溶酶体膜、抑制过量超氧化物的生成和清除产生的超氧化物、清除氧自由基、抑制炎症介质释放、减少细胞与组织损伤等药理作用。我们推测乌司他丁在急性炎症打击比如脓毒症过程中能够降低MMP-9的活性,从而减轻肺泡细胞外基质的降解。在本实验研究中,通过对脓毒症大鼠肺湿干重比、血清MMP-9浓度及肺脏组织MMP-9 mRNA表达水平的影响并结合肺脏形态学及超微结构的变化,探讨乌司他丁对肺脏的保护作用及其作用机制。方法:本研究应用盲肠结扎穿孔法(cecal ligation and puncture, CLP)复制严重感染动物模型,选用雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠90只,体重在250-300g之间,分为3组:假手术组(Sham group, n=30)、盐水组(NS group, n=30)﹑乌司他丁组(UTI group, n=30)。假手术组只开腹,牵拉盲肠但不结扎;盐水组行CLP后给予生理盐水10mL/Kg体重腹腔注射;乌司他丁组行CLP后给予乌司他丁10万U/Kg腹腔注射,浓度为1万U/mL。每组动物按时间点分为5个亚组(n=6),在CLP术毕0.5h、1.5h、3h、6h和12h观察大鼠一般情况的变化并处死动物。按时间点处死动物后,3h组留取右肺下叶组织,HE染色法光镜观察肺脏形态学改变,透射电镜观察肺脏的超微结构。留取左肺组织,RT-PCR半定量测定肺组织中MMP-9 mRNA的表达。在6h动物处死后,开胸取右肺中叶,吸干表面水分,再置于85℃烤箱中24小时至恒重,称干重,计算肺湿干重比(W/D)。通过颈总动脉插管取血2mL,离心后取上清,-80℃保存,ELISA法测定血清中MMP-9的浓度。数据采用SPSS11.5版软件包(SPSS Company, Chicago, Illinois, USA)进行统计分析,比较肺湿干重比、血清MMP-9浓度及肺组织MMP-9 mRNA表达水平的变化。采用完全单因素的方差分析,方差不齐时采用非参数的秩和检验。P<0.05认为差异有显著性,P<0.01认为统计学上有非常显著差异。结果1 CLP术后一般情况的观察:假手术组大鼠苏醒较早,清醒后活动基本如常,剖腹未见恶臭,腹腔水肿等表现。盐水组大鼠术后均有严重的脓毒症表现:苏醒延迟,逐渐出现精神萎靡,竖毛及呼吸困难等表现,剖腹可见恶臭味血性渗液,肠管水肿,部分盲肠坏死变黑。与盐水组大鼠相比,乌司他丁组动物临床表现较轻。2脓毒症大鼠肺组织湿干重比(W/D)变化:与假手术组相比,CLP术后6小时盐水组肺组织W/D比显著增加(5.15±0.11 vs 4.54±0.16, P<0.01);与盐水组相比,CLP术后6小时乌司他丁组肺组织W/D比显著减少(4.74±0.08 vs 5.15±0.11, P<0.01)。3肺脏形态学及超微结构变化:HE染色光镜下观察到假手术组大鼠肺组织结构完整,肺泡间隔无水肿,肺泡腔清晰;盐水组肺泡间隔增宽,肺间质充血,水肿,肺泡腔可见大量中性粒细胞浸润,可见不同程度的肺不张,代偿性肺气肿等;乌司他丁组改变明显减轻但较假手术组重。电镜下观察假手术组细胞绒毛、线粒体、板层小体正常;盐水组Ⅱ型肺泡上皮细胞线粒体大部分嵴,部分膜融合或消失,粗面内质网轻度扩张,脱颗粒现象明显,微绒毛数量显著减少,板层小体排空现象明显;乌司他丁组形态学及超微结构改变与盐水组相比均明显减轻。4大鼠血清MMP-9浓度检测结果:与假手术组相比,盐水组血清MMP-9浓度在各个时间点均显著升高(0.5h: 2895.8±268.4 pg/ml vs 2090.8±282.1pg/ml, P<0.01; 1.5h: 2884.7±176.9pg/ml vs 2292.4±157.0pg/ml, P<0.01; 3h: 2986.7±144.5pg/ml vs 2191.4±348.8pg/ml, P<0.01; 6h: 3096.3±384.9pg/ml vs 1957.3±286.5pg/ml, P<0.01; 12h: 2993.1±208.2pg/ml vs 1887.5±176.1pg/ml, P<0.01);与盐水组相比,乌司他丁组血清MMP-9浓度在各个时间点均显著下降(0.5h: 2428.9±166.7 pg/ml vs 2895.8±268.4 pg/ml, P<0.05; 1.5h: 2437.5±375.4pg/ml vs 2884.7±176.9 pg/ml, P<0.05; 3h: 2520.4±213.1pg/ml vs 2986.7±144.5 pg/ml, P<0.05; 6h: 2616.4±182.5pg/ml vs 3096.3±384.9 pg/ml, P<0.05; 12h: 274.9±148.7pg/ml vs 2993.1±208.2 pg/ml, P<0.01);与假手术组相比,乌司他丁组血清MMP-9浓度在0.5h组、1.5h组和3h组无统计学差异(0.5h: 2428.9±166.7pg/ml vs 2090.8±282.1pg/ml, P>0.05; 1.5h: 2437.5±375.4 pg/ml vs 2292.4±157.0pg/ml, P>0.05; 3h: 2986.7±144.5 pg/ml vs 2191.4±348.8 pg/ml, P>0.05),而在6h组和12h组血清MMP-9浓度显著升高(6h: 2616.4±182.5pg/ml vs 1957.3±286.5pg/ml, P<0.05; 12h: 274.9±148.7pg/ml vs 1887.5±176.0pg/ml, P<0.01)。5大鼠肺组织MMP-9 mRNA表达结果:与假手术组相比,盐水组MMP-9 mRNA表达在各个时间点均显著增加(3h: 0.833±0.115 vs 0.435±0.043, P<0.01; 6h: 0.883±0.034 vs 0.338±0.035, P<0.01; 12h: 0.853±0.023 vs 0.253±0.032, P<0.01);与盐水组相比,乌司他丁组MMP-9 mRNA表达在各个时间点均显著下降(3h: 0.610±0.080 vs 0.833±0.115, P<0.05; 6h: 0.470±0.092 vs 0.883±0.034, P<0.01; 12h: 0.468±0.013 vs 0.853±0.023, P<0.01);与假手术组相比,乌司他丁组MMP-9 mRNA表达在各个时间点均显著增加(3h: 0.610±0.080 vs 0.435±0.043, P<0.05; 6h: 0.470±0.092 vs 0.338±0.035, P<0.05; 12h: 0.468±0.013 vs 0.253±0.032, P<0.01)。结论1 CLP法能够成功复制大鼠脓毒症模型。2 MMP-9与炎症反应的程度密切相关,随着炎症反应的加重,其浓度不断升高;MMP-9与肺损伤密切相关,肺损伤越严重,MMP-9活性越高。3乌司他丁能够减少肺组织MMP-9 mRNA的表达,降低血清MMP-9的浓度,从而减轻肺损伤,保护肺功能。