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柑橘是世界上种植最广泛的水果之一。柑橘黄化脉明病毒（Citrus yellow clearing vein virus,CYVCV）是印度柑橘病毒属（Mandarivirus）的一种新发病毒,可通过柑橘粉虱（Dialeurodes citri）、绣线菊蚜（Aphis spiraecola）以及污染的刀具在柑橘之间进行高效传播,对柑橘产业尤其是柠檬产业具有重大威胁。CYVCV在柠檬（Citrus limon）和酸橙（C.aurantium）上引起黄脉病典型症状:叶脉黄化透明、嫩叶叶片反卷和皱缩,从而造成树势衰弱、果实产量下降,目前该病尚无有效防治药剂。本研究基于柑橘叶斑驳病毒（Citrus leaves blothing virus,CLBV）侵染性克隆CLBV201建立了病毒诱导的基因沉默（Virus-induced gene silencing,VIGS）体系,并在明确利用该体系沉默感病基因对柑橘溃疡病菌（Xanthomonas citri ssp.citri,Xcc）具有防效的基础上尝试干扰CYVCV,以期为黄脉病的防控提供新的技术手段。此外,感病苗木的早期诊断,也有助于监控黄脉病的传播流行。因而,本研究建立了CYVCV的逆转录重组酶聚合酶扩增（Reverse transcription-recombinase polymerase amplification,RT-RPA）检测方法,该方法快速简便、高效特异,对该病害的防控具有积极意义。所取得的主要研究结果如下:1、CLBV介导的基因沉默体系建立以本氏烟（Nicotiana benthamiana）16c和尤力克柠檬为材料,分别克隆绿色荧光蛋白（Green fluorescent proteins,GFP）、八氢番茄红素脱氢酶（Phytoene desaturase,PDS）和镁螯合酶（Magnesium chelatase）的sulfur（SU）亚基的基因保守片段,在初步构建VIGS载体p CLBV201的基础上,利用In-Fusion技术插入p CLBV201的多克隆位点,构建了系列重组载体p CLBV201-gfp471、p CLBV201-su245和p CLBV201-pds391,转化农杆菌GV3101后侵染烟草和柠檬。结果表明:p CLBV201-gfp接种7 d后,本氏烟16c开始出现绿色荧光淬灭的表型,在接种后7 d、20 d、30 d和40 d后gfp表达水平分别较对照组下降了43.66%、79.85%、94.23%和99.34%。p CLBV201-su245和p CLBV201-pds391和接种30 d后,柠檬叶片开始出现沉默表型,su和pds表达水平分别较对照下降了85.77%和88.34%,其总叶绿素和类胡萝卜素含量,分别降低了11.63%,和7.13%,且柠檬植株叶片的沉默表型可维持1年以上,部分新发叶片仍表现沉默表型。2、利用CLBV介导的VIGS防控柑橘病害1)侧生器官边界（Lateral organ boundaries,LOB）的lob基因是Xcc主要致病因子Pth A4的直接靶标基因。本研究利用所建立的VIGS体系构建了重组载体p CLBV201-lob376沉默该基因,以阻断Xcc与靶标基因结合,从而达到病害防控目的。研究结果表明:p CLBV-lob376接种植株lob基因表达量与对照相比降低了76.91%。采用离体针刺法进行柑橘溃疡病抗性评价,在接种10 d后统计病斑面积、病情指数和叶片含菌量评价其抗性,结果显示试验组发病情况明显减轻,其病斑面积较对照组下降了63.85%,病情指数较对照组下降了14.25%,其叶片含菌量较对照组下降了66.67%。2)构建了靶向CYVCV的ORF（Open reading frame）1、ORF5、ORF6和TGB（Triple gene blocks）的重组载体:p CLBV201-CY297、p CLBV201-CY311、p CLBV201-CY310和p CLBV201-CY313,分别接种尤力克柠檬。获得阳性植株后,通过柑橘粉虱取食开展CYVCV攻毒实验。不过,本试验中实验组与对照组目前均未检测到柑橘黄化脉明病毒。3、CYVCV RT-RPA检测方法的建立根据CYVCV的外壳蛋白（Coat protein,CP）的基因保守序列设计了5对引物,通过样品检测筛选出扩增效果好、特异性强的引物对,将选出的引物进行标记物修饰,并设计对应的特异性探针,对反应时间和反应温度进行优化,建立了CYVCV的RT-RPA检测体系:最佳引物为CY1-F/R,对应探针为CY1-Probe（47 bp）,最佳反应条件为39°C,30 min,特异扩增目的片段为177 bp。分别以仅感染了不同柑橘病害的柑橘材料的总核酸为模板,评价所建RT-RPA检测体系的特异性,该检测体系仅对感染了CYVCV的样品检测结果为阳性,其余均为阴性;将感染了CYVCV的柑橘总RNA样品进行10倍梯度稀释,平行进行RT-PCR及RT-RPA的检测,评价所建立检测方法的灵敏度,结果显示,RT-RPA与RT-PCR方法均最低可检测到10-4稀释液,两种方法检测灵敏度相当;将所建立的检测体系用于检测随机采集来自田间的不同品种的柑橘样品,同时进行RT-RPA和RT-PCR检测,以检验所建RT-RPA检测方法的适用性,结果显示在随机采集的45株田间柑橘样品中,RT-PCR与RT-RPA的均检测出37个阳性样品,检出率均82.2%。该检测方法简便快速,对CYVCV的防控具有一定意义。