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鳜(Siniperca chuatsi)是我国重要的淡水经济养殖鱼类之一,对其先天免疫系统相关分子的研究在理论和应用方面均具有重要的意义。本研究克隆了鳜两种抗菌肽基因,β防御素(β-defensin)和hepcidin,以及CXC型趋化因子白介素-8基因(interleukin-8,IL-8),对基因的表达特性进行了分析,并对β防御素和白介素-8的功能进行了研究。
通过RT-PCR和RACE-PCR技术获得了鳜β防御素、hepcidin和白介素-8的cDNA全长,并采用Genome Walking的方法获得了三个基因的基因组序列和β防御素的启动子区域,分析了三个基因的基因组结构。利用原核和真核表达技术获得了β防御素和IL-8的重组蛋白,分别研究了其抑菌活性和趋化活性。
鳜β防御素(Siniperca chuatsiβ-defensin,ScBD)基因组全长1197 bp,包含三个外显子和两个内含子,开放阅读框包含192 bp,编码63个氨基酸,由20个氨基酸的信号肽和43个氨基酸的成熟肽组成。启动子区域包含与抗细菌和抗病毒转录调控相关的转录因子结合位点,如:NF-κB、Spl、C/EBP-β和IRF-1等。健康鳜的ScBD mRNA在各个组织中呈组成型表达,并且主要表达于脾脏,LPS刺激之后在肝脏、鳃、肠、脾脏和肌肉(含皮肤)中呈上调表达,在肌肉(含皮肤)中表达量最高。利用原核表达的ScBD重组蛋白制备的鼠多克降抗体,经WesternBlot技术检测到ScBD蛋白表达于脾脏、头肾和鳃中。原位杂交技术检测到ScBD阳性细胞主要分布于脾脏组织血管周围的黑色素巨噬细胞中心内,头肾组织的小血管内。真核重组表达质粒pcDNA3.1-ScBD转染HEK293T细胞,分泌表达的蛋白对大肠杆菌M15有抑菌作用。
鳜hepcidin基因组全长980 bp,包含三个外显子和两个内含子,开放阅读框包含261 bp,编码86个氨基酸,由信号肽、前导肽和成熟肽组成。鳜hepcidinmRNA在健康组织内呈组成型表达,并且在肝脏中的表达量最高,在LPS刺激之后的肠和鳃组织中呈上调表达。
鳜IL-8基因组全长1164 bp,包含四个外显子和三个内含子,开放阅读框包含300 bp,编码99个氨基酸,含有22个氨基酸的信号肽和77个氨基酸的成熟肽。鳜IL-8前两个半胱氨酸形成典型的CXC型结构,在第一个半胱氨酸上游没有ELR特征基序。IL-8 mRNA在健康鳜的头肾中表达量最高,在LPS刺激后的头肾、鳃和脾脏中呈上调表达。原核表达的鳜IL-8重组蛋白在浓度为15 ng/mL时对头。肾白细胞具有明显的趋化作用,主要趋化淋巴细胞。IL-8重组蛋白在浓度为1500 ng/mL时可以诱导促炎因子IL-1β和TNFα表达。