随着工业燃煤的增多、汽车尾气的大量排放造成了严重的空气污染。最近20年左右时间,肺癌在我国的发病率呈递增趋势。今天我国男性肺癌患者已经在男性恶性肿瘤中占据首位,同时女性发病率也迅速增高,很有可能在未来超越子宫癌成为女性第一高发性癌症。肺癌显然已经成为了危害人类生命健康的一种恶性疾病。因此,开发治疗肺癌的药物显得尤为迫切。异喹啉类生物碱(isoquinoline alkaloid)广泛分布于生物界中,其在抗炎、抗菌、调节免疫系统、调节心脑血管上具有较好生物活性,部分类型异喹啉生物碱也具有抗肿瘤的作用。我们选用了自主合成的异喹啉亚胺类生物碱B4、B13、B20进行了对肺癌A549细胞的抗肿瘤活性筛选。结果发现,异喹啉亚胺类生物碱B4、B13、B20在体外对肺癌细胞A549展现出较好的增殖抑制作用。我们的研究发现,异喹啉亚胺生物碱B20(24μM处理3,6,12h后)可以显著增加肺癌A549细胞胞内的ROS 水平,并诱导肺癌细胞A549发生线粒体膜电位下降。异喹啉亚胺生物碱B20处理肺癌A549细胞(2,6,12,24μM浓度处理24h)Western Blot结果表明,异喹啉亚胺生物碱B20能引起p53、HSP70、HSP90、GRP78蛋白表达量增加,Caspase-3、PARP、Caspase-9的剪切激活和Bax/Bc12蛋白表达量比值的增加,同时,线粒体细胞色素C降低而胞质中细胞色素c增加。联合NAC(氧化损伤抑制剂)抑制胞内的ROS后,逆转了 B20诱导 A549 细胞导致的 PARP、Caspase-3、Caspase-9 的切割。同时,采用 Annexin-V-PI方法检测凋亡(B20取24μμM处理24h),发现对照组凋亡率为6.6%,B20加药组凋亡率为31.3%。因此,异喹啉亚胺生物碱B20在体外可以诱导人肺癌A549细胞产生ROS并且诱导细胞发生内源性凋亡,且异喹啉亚胺生物碱B20诱导的凋亡依赖于ROS的产生。进一步研究发现,异喹啉亚胺生物碱B20在24μM处理肺癌A549 48h后会产生大量空泡膜结构;Western Blot结果表明,异喹啉亚胺生物碱B20能够诱导自噬相关蛋白LC-3Ⅱ表达量的升高;荧光显微镜下观察结果显示,B20可以诱导转染GFP-LC-3质粒的A549细胞出现大量的GFP-LC-3点状聚集,且24h内随着B20(2,6,12,24μM浓度)处理A549,细胞内发生绿色GFP-LC-3点状聚集的比例由3.7%升高至34.3%;同时配合流式细胞仪使用Acridine orange染色发现酸性自噬溶酶体随B20浓度升高而增加;使用自噬抑制剂巴佛洛霉素A1和B20处理肺癌细胞A549后,A549凋亡明显增强。研究结果表明,异喹啉亚胺生物碱B20可诱导肺癌A549细胞发生自噬,且自噬是作为一种保护性作用。我们的研究还发现,B20(2,6,12,24μM)浓度梯度处理A549细胞可增加JNK的磷酸化水平,且B20(24μM)作用A549细胞24小时有明显的P-JNK表达。当使用NAC和B20联合处理A549后JNK的磷酸化水平受到抑制。联合使用JNK抑制剂sp600125(10μM)和Sh JNK干扰后,B20诱导A549产生的凋亡和自噬作用均受到明显抑制。综上所述,本部分研究发现异喹啉亚胺类生物碱B4、B13、B20可以显著抑制肺癌A549细胞的增殖;异喹啉亚胺生物碱B20在体外能够诱导肺癌A549细胞产生ROS,并稳定A549细胞中野生型P53的表达,并诱导细胞发生线粒体途径的凋亡;同时B20诱导A549细胞自噬并激活了 JNK。B20对A549细胞的抗肿瘤作用是诱导了细胞的凋亡和自噬,且此作用依赖于ROS的产生和JNK的激活。肿瘤血管的生成在肿瘤的生长、转移和演进中扮演者非常重要的角色。实体瘤的生长依赖于持续和广泛的血管生长。因此,抑制肿瘤的血管形成,可以有效的抑制肿瘤生长。在肿瘤的新生血管过程中血管内皮生长因子和血管内皮生长因子受体共同作用介导其信号通路传导。其中,VEGF/VEGFR是调节血管生成的主要调控因子。目前已经有多种靶向VEGF/VEGFR信号通路的特异性酪氨酸激酶抑制剂被批准上市,并成功应用在肿瘤的临床治疗中。开发针对肿瘤血管形成机制的酪氨酸激酶抑制剂,是目前抗肿瘤血管生成策略的主要方法。以开发自主产权的抗肿瘤血管生成酪氨酸激酶抑制剂为目的,我们对自主合成的“2-芳基笨并噁唑类--YQY、吲哚酰胺类—ZJQ”系列化合物进行了细胞水平和动物模型水平的抗血管生成活性筛选,筛选得到了活性化合物ZJQ-24。并对ZJQ-24的抗血管生成作用机制进行了研究。首先,我们采用鸡胚尿囊膜模型和MTT法对合成的靶向受体酪氨酸激酶化合物进行了筛选,筛选出了数个有抑制鸡胚尿囊膜血管形成的的化合物。HUVEC细胞增殖法筛选能抑制其增殖的化合物,发现在有VEGF刺激和无VEGF刺激下 ZJQ-24 在 HUVEC 的 IC50分别为 9.02±0.3μM 和 37.5±0.2μM。随后,划痕实验中发现2.5μM ZJQ-24处理HUVEC细胞24h抑制了 51.4%的血管内皮细胞的迁移。与此同时,ZJQ-24在5μM时可以抑制48.5%HUVEC细胞在基质胶上微管的形成。进一步研究发现ZJQ-24可以抑制HUVEC细胞的VEGFR2磷酸化水平以及下游信号通路中AKT、ERK、FAK及Src等重要信号分子的磷酸化作用,且具有浓度依赖性。ZJQ-24 对人肿瘤细胞 HCT116、SW480 和 HEPG-2 的IC50分别是 8.10±1.8μM、7.90±1.3μM、8.3±2.2μM,对肿瘤细胞的细胞毒性远大于人正常胚肺细胞MRC-5的 IC50(大于 100),并且 ZJQ-24(1、2.5、5、10、20μM)处理 24h可以诱导HEPG-2细胞出现PARP和Caspase-3切割,提示ZJQ-24可诱导肿瘤细胞HEPG-2的凋亡。综上所述,ZJQ-24通过抑制VEGFR2以及其下游重要信号分子产生了抗血管生成作用。同时ZJQ-24对于肿瘤细胞具有较好的活性,并可以诱导肿瘤细胞HEPG-2产生PARP和Caspase-3切割产生凋亡。因此,我们筛选出的自主合成的化合物ZJQ-24具有显著的抗血管生成和抗肿瘤作用。