引言CYP17A1(cytochrome P450,family 17,subfamily A,polypeptide 1)基因的突变可损害肾上腺和性腺中类固醇激素的合成,导致17a-羟化酶/17,20裂解酶缺陷症(17-hydroxylation/17,201yase deficiency,17OHD)(OMIM:202110),临床主要表现为高血压、低血钾、女性性幼稚和原发性闭经、男性假两性畸形。目前,国内外对17a-羟化酶缺陷症的研究重点主要有两方面。第一,通过直接对CYP17基因测序,确定其突变位点,进而构建含突变点的重组体,从细胞水平鉴定突变蛋白体的功能;第二,利用各种生物信息学软件以及信息资料库构建出P450C17的计算机三维结构模型,借以预测分析基因突变对蛋白的空间结构以及功能造成的可能影响。迄今为止,全球已有300多例,国内有50多例,但多为临床报道,采用分子遗传学研究的仅限于几家医院。因此,本文分析了同患17a-羟化酶缺陷症的姐妹俩的临床特点,同时对姐妹俩及其父母的CYP17A1基因直接测序,借助人类P450c17酶计算机模型,从分子生物学角度探讨了17OHD的可能发病机制。材料和方法1.研究对象先证者,对象Ⅰ:15岁,社会性别女,核型为46,XX。郑州大学第一附属医院2007年12月收住的住院病人,通过临床资料及实验室检查确诊17a-羟化酶缺陷症;对象Ⅱ:13岁,社会性别女,核型为46,XY,先证者的同胞妹妹,因其姐患17a-羟化酶缺陷症经收集其临床和实验室资料诊断为17a-羟化酶缺陷症;同时收集姐妹俩及其父母的空腹抗凝血5ml。2.基因组DNA的提取在签署知情同意书的基础上,应用经典的苯酚—氯仿—异戊醇抽提法从研究对象的外周血中提取基因组DNA。3.拟扩增序列的确定和聚合酶链式反应(PCR)扩增设计8对引物,采用PCR法扩增CYP17A1基因的8个外显子及外显子与内含子的连接区域;部分PCR产物克隆至pMD-18T Easy载体。琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物,产物胶回收后直接作为DNA双链模板测序。4.PCR产物的纯化和DNA测序分析PCR产物纯化后,用ABI3700荧光自动测序仪利用荧光标记双脱氧核苷终止法测序。质粒纯化后,用M13 Primers进行测序,方法同上。5.测序结果分析及计算机模型预测测序结果用DNAStar6.1软件与标准序列进行比对(Gene Bank编号M63871),并用Auchus等创建的人类P45017酶计算机模型预测突变酶蛋白可能的功能变化和机制。结果1.杂合突变第六外显子6535 C＞T,导致氨基酸R362C,突变来自父亲,母亲为正常序列;2.片段缺失第八外显子8323-8331delTCGACTCTT导致delD487_F489,突变来自母亲,父亲为正常序列;3.同义突变①第一外显子第46个氨基酸:H46H(CAT→CAC);第65个氨基酸:S65S(TCT→TCG);②第五外显子第283个氨基酸:D283D(GAT→GAC);4.CYP17基因多态性第四外显子5’端-2bp处插入一碱基C,IVS4-2insC,即正常为ATTTCCAGATT,而测序结果为ATTTCCCAGATT,四人均存在,推测可能为基因的多态性;5.P450c17酶计算机模型预测第六外显子R362C,通过减弱POR到P450c17的电子传递来削弱酶的功能;第八外显子TCG ACT CTT缺失改变了β-折叠的结构,从而减弱酶的功能。结论分析了同患17a-羟化酶缺陷症的两姐妹及其父母的基因特点,发现了一错义突变(R362C)及一9bp(TCGACTCTT)的片段缺失。R362C是巴西人群中常见突变类型之一;9碱基(TCGACTCTT)缺如致D487_S488_F489缺失,是中国人群的常见突变类型。并通过P450c17酶人类计算机模型阐述了其可能的发病机理。