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背景与目的谷氨酸(Glutamate,Glu)是广泛参与机体代谢和神经传导的神经递质,然而高浓度谷氨酸将导致兴奋毒性、氧化损伤和炎症反应,参与脑卒中、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症等神经系统疾病的病理生理过程。探寻抗谷氨酸损伤的有效治疗靶点具有重要意义。在谷氨酸损伤的机制研究中,有研究表明谷氨酸损伤后会引起单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(Adenosine 5‘-monophosphate(AMP)-activated protein kinase,AMPK)激活,抑制AMPK通路具有减轻谷氨酸损伤的作用。关于AMPK在神经系统疾病中的作用及其机制的研究较少且结论不完全一致,弄清AMPK的作用机制,在合适的时机适度调节AMPK活性有望成为相关神经系统治疗的新靶点。脑红蛋白(Neuroglobin,Ngb)是在本世纪发现的主要位于神经系统的携氧球蛋白,在神经系统疾病中有较为明确的神经保护作用,然而作用机制仍未明确。有研究表明Ngb能抑制AMPK通路,促进合成代谢。Ngb是否对谷氨酸损伤有保护作用?AMPK是否在谷氨酸损伤中发挥调控作用?Ngb是否介导AMPK在谷氨酸损伤中发挥作用?Ngb如何介导AMPK在谷氨酸损伤中发挥作用?本课题针对这些问题进行研究,进一步揭示Ngb神经保护作用机制,以期为神经系统疾病的神经保护治疗方面提供新靶点。方法1、通过构建过表达Ngb的HT22细胞稳定转染株,在谷氨酸损伤模型基础上,联合Calcein AM、Western Blot等方法,观察谷氨酸干预后细胞形态学、细胞生存率等情况,明确Ngb在HT22细胞中的抗谷氨酸损伤作用。2、使用AMPK激活剂(AICAR)和AMPK抑制剂(Compound C)对HT22细胞谷氨酸损伤模型进行干预,应用Calcein AM、ROS、Western Blot等检测方法观察激活及抑制AMPK通路对谷氨酸损伤后的细胞生存率、细胞氧化应激损伤及相关蛋白表达情况,明确AMPK在HT22细胞谷氨酸损伤中的作用。3、使用过表达Ngb的HT22细胞稳转株构建谷氨酸损伤模型,分别使用AMPK激活剂(AICAR)及AMPK抑制剂(Compound C)对谷氨酸损伤细胞进行预处理,联合使用Calcein AM、ROS、Western Blot等检测方法观察激活及抑制AMPK对HT22-Ngb谷氨酸损伤后的细胞生存率、细胞氧化应激损伤及相关蛋白表达情况,明确Ngb能否调控AMPK并在谷氨酸损伤中发挥保护作用,进一步探讨其机制。结果1、1mMol以上谷氨酸干预HT22细胞16小时后细胞生存率下降,随着谷氨酸的浓度增加,细胞生存率呈现逐渐下降趋势。4mM谷氨酸干预后,细胞生存率为46.21±10.6%,细胞状态较差,形态改变,形状变小,结构紊乱,突起减少,细胞损伤较为明显,为中度损伤。所以后续实验中我们选择用4mM谷氨酸干预16小时制备细胞损伤模型。2、成功构建过表达Ngb的HT22细胞稳定转染株,在此基础上制备谷氨酸细胞损伤模型,结果发现在相同浓度的谷氨酸干预下,与HT22-GFP细胞相比,HT22-Ngb细胞生存率明显提高。在4mM谷氨酸干预后,HT22-Ngb细胞生存率较HT22-GFP细胞增加62.44±5.47%(P<0.0001)。提示过表达的Ngb在HT22细胞中具有抗谷氨酸损伤作用。3、分别使用AMPK激活剂(AICAR)和抑制剂(Compound C)干预HT22细胞,发现1mM AICAR和5μM Compound C分别对AMPK的激活和抑制效果较好。使用AICAR对谷氨酸损伤的细胞生存率上并没有太大影响,而使用Compound C后谷氨酸损伤细胞的细胞生存率增加了84.26±5.16%(P<0.0001),ROS明显减少。提示抑制AMPK活性对谷氨酸诱导的HT22细胞损伤具有保护作用,作用可能与其抑制氧化损伤有关。4、给予4mM谷氨酸干预后,与HT22-GFP组相比,HT22-Ngb组的细胞生存率增加了62.44±5.47%(P<0.0001),而同时加用AICAR+谷氨酸干预后,HT22-Ngb原本被抑制的AMPK活性重新被激活,细胞生存率降低了57.20±4.12%(P<0.0001),ROS明显增加,Ngb的保护作用被剥夺。同时加用Compound C+谷氨酸干预后,与谷氨酸干预组比较,HT22-Ngb的AMPK水平无明显抑制,细胞生存率、ROS水平均无明显差异,未能获得更进一步的保护作用。5、HT22-Ngb细胞内HIF-1α的表达量较HT22-GFP细胞减少32.69±12.12%(P<0.05)。对于HT22-Ngb细胞,谷氨酸干预后HIF-1α的表达量未发生明显改变;同时加用AICAR+谷氨酸干预后HIF-1α增加46.49±15.67%(P<0.05)。6、给予4mM谷氨酸干预后,HT22-GFP细胞的Bax水平上调48.08±18.38%(P<0.05),BCL-2磷酸化水平下调53.63±11.81%(P<0.05);给予4mM谷氨酸干预后HT22-Ngb细胞的Bax、BCL-2活化水平无明显改变。结论1、过表达的Ngb在HT22细胞中发挥抗谷氨酸损伤作用。2、抑制AMPK活性对谷氨酸诱导的HT22细胞损伤具有保护作用,可能通过减轻氧化应激损伤来实现的。3、Ngb通过抑制AMPK活性在HT22细胞中发挥抗谷氨酸损伤作用。4、Ngb调控AMPK活性并在HT22细胞中发挥抗谷氨酸损伤作用,可能与其减轻氧化应激水平、调控HIF-1α及细胞凋亡途径有关。