论文部分内容阅读
背景原发性肝癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一,居我国恶性肿瘤死亡原因的第二位,仅次于肺癌。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)最为常见,占原发性肝癌的90%。乙型和丙型肝炎病毒感染、酗酒、长期接触黄曲霉毒素、饮水污染、代谢紊乱和年龄是HCC发生和发展的多种危险因素。目前,手术切除及肝移植是HCC最有效的治疗手段,射频消融、动脉栓塞化疗(TACE)、放疗及索拉非尼等靶向药物治疗也均可改善患者预后,提高患者的5年生存率。尽管这些治疗在临床疗效方面取得了一些进展,但结果仍然差强人意。因此,积极寻求新的治疗途径、探索新的作用靶点已成为治疗HCC和改善患者预后的关键。微管亲和性调节激酶2(microtubule affinity regulating kinase 2,MARK2)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,参与微管相关蛋白的磷酸化,如Tau蛋白、参与细胞周期调节的磷酸酶(CDC25),以及IIa类组蛋白去乙酰酶(如HDAC7)。在哺乳动物中,MARK家族由四个成员(MARK1-MARK4)组成。Matenia等人研究发现MARK2具有多种功能,包括在神经分化、神经退行性变、细胞极性、细胞内转运和细胞迁移中的作用,其中一些功能在癌细胞中被解除管制。Hubaux等人发现在肺癌细胞系中,MARK2在DNA和RNA水平存在高度频繁破坏,这些改变导致细胞系获得致癌性质,如生存力增加和锚定非依赖性生长。但也有研究表明,利用可诱导的慢病毒表达系统,在LKB1缺陷的宫颈癌HeLa细胞中高表达MARK2,可以通过AMPK通路逆转上皮-间质转化(EMT),抑制HeLa细胞的生长。MARK2在肝癌中的表达及其临床意义未见研究报道,基于上述背景,本研究对MARK2在肝癌中的表达情况做初步探讨,旨在为HCC的临床治疗提供新的靶点和思路。目的:探讨MARK2在肝癌组织及其癌旁组织中表达水平的差异;研究MARK2过表达后对肝癌HepG2细胞迁移能力的影响。方法:1.组织芯片(HLivH030PG03-M-250)购自上海芯超生物科技有限公司,包含65例肝癌组织及其对应的癌旁组织标本。运用免疫组化法检测MARK2在肝癌组织及其癌旁组织中的表达情况。2.运用UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/)分析癌症基因图谱(TCGA)数据库中MARK2在肝癌组织与正常肝组织中表达的差异,及其与肝癌患者临床病理特征的关系;运用网络在线生存期分析软件Kaplan-Meier plotter分析MARK2的表达对肝癌患者生存预后的影响。3.将MARK2过表达质粒(MARK2转染组)和空载体阴性对照质粒(Negative control,NC组)稳定转染至肝癌HepG2细胞中,并筛选培育出MARK2真核表达载体稳定转染的肝癌细胞株和阴性对照组细胞株,上调MARK2在HepG2细胞中的表达,Western blot方法检测MARK2在实验组与阴性对照组蛋白水平的表达情况;4.运用划痕试验和Transwell实验检测MARK2过表达后对HepG2细胞迁移能力的影响。结果:1.运用UALCAN分析TCGA数据库结果:与正常肝组织相比,MARK2在肝癌组织中的表达明显升高(P<0.001);肝癌组织中MARK2高表达与TNM分期及病理分级显著相关(P<0.001);免疫组化结果:MARK2在肝癌组织中的表达与癌旁组织相比明显升高。2.Kaplan-Meier plotter生存分析结果:MARK2高表达患者5年生存率明显低于MARK2低表达组(P<0.01)。3.Western blot检测实验结果:转染MARK2过表达质粒后,实验组的MARK2表达水平显著高于NC组。结果表明HepG2细胞在转染MARK2过表达质粒后,MARK2的表达水平明显升高。4.Transwell实验结果:与NC组相比较,转染MARK2过表达质粒实验组通过滤膜迁移至下室的HepG2细胞数明显增多,其差异具有统计学意义(226±10.017vs 98±10.536,t=15.290,P<0.05)。表明MARK2过表达能够促进HepG2细胞的迁移。5.划痕实验结果:细胞划痕后继续培养48h,转染过表达MARK2的HepG2细胞划痕愈合率为53.8%,而阴性对照组划痕愈合率为32.3%,差异有统计学意义(P<0.05),表明过表达MARK2后,HepG2细胞迁移能力增强。结论1.MARK2在肝癌组织中表达明显高于癌旁组织;肝癌组织中MARK2的表达与TNM分期及病理分级显著相关;MARK2高表达的肝癌患者总生存期较短,预后不良。2.MARK2能促进肝癌细胞的迁移,可能在肝癌中发挥促癌作用。