背景与目的温热治疗（HT）是指通过将组织温度加热到高于人体正常温度（通常在42-45℃）并维持一段时间以达到治疗目的的方法,目前报道常用于治疗恶性肿瘤和人乳头瘤病毒（HPV）感染性疾病。既往研究表明,温热治疗可增强组织局部的抗原特异性细胞免疫反应,治疗皮肤和宫颈的HPV感染性疾病,联合热疗可以提高癌组织对放疗、化疗的敏感性。HPV具有高度的宿主特异性,迄今为止未发现除人以外的其它天然宿主。HPV主要感染人的上皮细胞（如皮肤、外阴、宫颈、鼻咽部粘膜等）引起各类疾病,如寻常疣、尖锐湿疣、宫颈癌、头颈鳞状细胞癌等,其中高危型HPV（包括HPV 16/18）感染是宫颈癌、阴茎癌的主要危险因素。本课题组的前期研究发现,对人正常包皮组织、尖锐湿疣组织、永生化人角质形成细胞（HaCaT）和HPV16/18高拷贝人宫颈癌上皮细胞（Ca Ski）进行温热刺激后,热休克蛋白DnaJA4表达显著上调,DnaJA4敲除可增强温热对NF-kappa B通路和ERK通路的激活效应。热休克蛋白（HSPs）通常由冷热刺激、微生物感染、紫外线照射等因素诱导表达于细胞内或细胞外环境中。根据HSPs的分子量大小可将其分为小分子HSPs、HSP40s、HSP60s、HSP70s、HSP90s和HSP110s等。DnaJA4是HSP40s家族成员,目前已知的主要功能是作为HSP70s的分子伴侣,参与蛋白质折叠和物质能量代谢。有研究发现,在温热刺激状态下,HSP40s家族中只有DnaJA4、Dna JB1和Dna JB4表现出显著上调。DnaJA4作为HSP40s家族中受温热影响较为显著的成员,是否在温热治疗恶性肿瘤和HPV感染性皮肤病中起着关键作用,值得进一步探索。本研究旨在阐明温热治疗过程中DnaJA4的上调对人正常上皮细胞和HPV高拷贝的人上皮细胞功能产生哪些影响,为温热疗法的进一步应用提供理论参考。方法本研究以HaCaT细胞和Ca Ski细胞为研究对象,用44℃水浴加热方式对细胞进行温热刺激,使用慢病毒载体转染的方法构建基因特异性过表达或敲减的细胞模型。观察温热处理中DnaJA4敲减对HaCaT细胞和Ca Ski细胞生理功能的影响。使用i TRAQ标记的液相色谱-质谱联用技术,分析DnaJA4敲除后HaCaT细胞的蛋白质组学变化并进行生物信息学分析;用CCK-8测定温热处理和DnaJA4敲除对细胞增殖活性的影响;用划痕实验和免疫印迹观察DnaJA4敲除对细胞迁移能力的影响及其调控机制;使用实时荧光定量PCR技术检测DnaJA4等分子的m RNA表达;使用免疫印迹技术检测DnaJA4、MYH9、MMP-9、PKM以及细胞迁移相关蛋白的表达,使用免疫共沉淀方法研究DnaJA4与PKM之间的蛋白质相互作用。统计学分析方法:组间比较使用配对t检验或方差分析,数据用（?）±SEM表示,P值小于0.05时认为差异有统计学意义。使用Graph Pad Prism 9.0软件进行统计学分析和图表制作。在本实验结果所有图表的统计检验结果中,*表示P值＜0.05,**表示P值＜0.01,***表示P值＜0.001,****表示P值＜0.0001,ns表示无统计学意义。结果（1）在HaCaT细胞敲除DnaJA4与野生型细胞的差异蛋白组学分析中,共鉴定到5344个蛋白质,其中4573个蛋白质具有定量信息。以表达差异倍数大于1.3或小于1/1.3作为上调/下调阈值、P值小于0.05为具有统计学意义,共筛选出388个差异表达蛋白,其中178个显著上调、210个显著下调。对这些差异表达蛋白进行GO注释后发现,在生物进程中主要分布于细胞进程、代谢进程、生物调节等;在细胞组成中主要为蛋白质复合体、细胞内解剖复合体等;在分子功能中主要体现为结合、催化分子、翻译调节、转运调节、结构分子活性等。这些差异表达蛋白主要定位于细胞质、细胞膜、细胞核、线粒体和细胞间。GO和KEGG功能富集分析提示差异蛋白主要富集于丙酮酸代谢、脂质代谢、糖酵解、结合活性、细胞骨架、细胞迁移和粘附等。（2）DnaJA4敲除/敲减后,HaCaT细胞迁移增强、Ca Ski细胞迁移减弱,HaCaT细胞MYH9、MMP-9蛋白表达上调,Ca Ski细胞MYH9蛋白表达下调;温热刺激后HaCaT细胞迁移增强、Ca Ski细胞迁移能力无明显变化;DnaJA4过表达或温热刺激后,HaCaT细胞MMP-9蛋白表达下调;DnaJA4敲减、温热刺激条件下,HaCaT细胞、Ca Ski细胞增殖活性无显著变化。HaCaT细胞蛋白质免疫共沉淀中DnaJA4与MYH9阳性。（3）应用HSP90α抑制剂CH5138303后,HaCaT细胞和Ca Ski细胞迁移减少,HaCaT细胞DnaJA4表达上调、MYH9表达下调。（4）应用HSP90α抑制剂CH5138303后,DnaJA4敲减的HaCaT细胞迁移和MYH9蛋白表达较对照组增强;对Ca Ski细胞联合应用HSP90α抑制剂和温热刺激,下调MYH9和HPV16 E6蛋白表达。（5）温热刺激条件下,HaCaT细胞和Ca Ski细胞DnaJA4基因转录和蛋白表达水平上调,PKM转录、PKM1、PKM2蛋白表达和PKM2磷酸化无明显变化;DnaJA4敲除后,温热刺激中上述基因转录和蛋白表达无明显变化;HaCaT细胞和Ca Ski细胞DnaJA4与PKM1、PKM2之间蛋白质免疫共沉淀阴性。结论（1）蛋白质组学研究表明,与野生型相比,DnaJA4敲除后的HaCaT细胞差异表达蛋白主要富集于分子结合、能量代谢和细胞迁移、细胞骨架等方面;上调蛋白的功能主要为促进细胞生长、有丝分裂、细胞迁移和细胞骨架重组。（2）温热诱导的HaCaT细胞DnaJA4上调与MYH9之间存在相互作用,DnaJA4缺失可增强温热刺激下的HaCaT细胞迁移、抑制Ca Ski细胞迁移。（3）DnaJA4上调参与HSP90α抑制剂对HaCaT细胞和Ca Ski细胞迁移的抑制作用。温热刺激联合HSP90α抑制剂显著下调Ca Ski细胞HPV16 E6和MYH9蛋白的表达。（4）温热刺激可上调HaCaT细胞和Ca Ski细胞的DnaJA4表达;温热刺激诱导的DnaJA4对PKM1/PKM2表达没有直接作用,DnaJA4与PKM1/PKM2不存在直接相互作用关系。