论文部分内容阅读
【目的】 1. 通过生物信息学分析预测等实验方法验证帕金森病中的新 miRNA 相关调控网络及关联蛋白和PD 潜在新靶点，探寻PD 致病机制中的新代谢通路。 2. 验证预测得到的miR-15家族成员是否对预测得到的靶基因NUCKS1有调控作用。 3. 通过转录组分析寻找NUCKS1 在PD 中关联的潜在病理通路。 【方法】 1. 以 PD 公共信息数据库为基础，通过分析预测新的 miRNA 调控网络及关联蛋白，得到miRNA15a/15b/16及NUCKS1在PD中具有潜在关联性。 2. 利用 RT-PCR 技术检测：PD 模型小鼠和 C57 小鼠脑组织中miRNA15a/15b/16及NUCKS1 mRNA表达水平；PD模型细胞与空白对照组细胞（转染空载质粒的SH-SY5Y 细胞）中miRNA15a/15b/16 和NUCKS1 mRNA表达水平。验证miRNA15a/15b/16及NUCKS1 mRNA在PD中的表达情况。 3. 利用 RT-PCR 技术检测实验组（转染 miRNAs 模拟物或抑制剂的SH-SY5Y 细胞）和空白对照组（转染乱序的 miRNAs 模拟物或抑制剂的SH-SY5Y 细胞）中 miRNA15a/15b/16 及 NUCKS1mRNA 表达水平，探寻miRNA15a/15b/16是否与NUCKS1具有调控关系。 4. 利用 Lenti-Crispr-Cas9 定点敲除 NUCKS1 基因慢病毒载体，感染SH-SY5Y细胞建立NUCKS1 knockout神经细胞模型。 5. 利用siRNAs knockdown NUCKS1，经转录组测序分析，筛选NUCKS1可能参与PD病理进程通路。 【结果】 1. 通过生物信息学分析获得miR15家族（miR15a/15b/16）在PD脑内表达水平降低，并预测得到miR15家族的靶基因NUCKS1在PD中表达显著上调。 2. 与C57小鼠脑组织相比，PD模型小鼠脑组织中miRNA15a/15b/16三者表达水平均下降，有统计学意义（P<0.05）；NUCKS1 mRNA 表达水平上升，有统计学意义（P<0.05）。与空白对照组相比，PD细胞模型组中miRNA15a/15b/16三者表达水平均下降，有统计学意义（P<0.05）；NUCKS1 mRNA 表达水平上升，有统计学意义（P<0.01）。 3. 在SH-SY5Y细胞中，与空白对照组相比，实验组（转染miR15a/15b/16 mimics的SH-SY5Y细胞）中NUCKS1 mRNA表达水平和蛋白水平无统计学意义（P>0.05）。与空白对照组相比，实验组（转染 miR15a/15b/16 inhibitors 的SH-SY5Y细胞）中NUCKS1 mRNA表达水平无统计学意义（P>0.05）。 4. 构建NUCKS1基因敲除慢病毒载体，感染SY-SY5Y细胞，SH-SY5Y细胞死亡，暗示NUCKS1基因knockout致死，因此转而采用RNAi干扰方法研究NUCKS1生物功能。 5. 构建3条NUCKS1 RNAi 干扰载体，筛选其对NUCKS1干扰作用。与转染空载体SH-SY5Y细胞相比，siRNAs（NUCKS1-Homo-410）转染的SH-SY5Y细胞中NUCKS1 mRNA表达水平降低最为显著。 6. siRNA（NUCKS1-Homo-410）knockdown NUCKS1，转录组进行测序。结果如下： 6.1 共筛选出14,980个差异基因，有414个有显著性（342个上调，72个下调）；6.2 GO分析结果显示，差异表达基因主要以结合功能为主，其编译的蛋白主要位于胞浆和胞外区，且主要参与防御反应、免疫反应。富集到GO通路的上下调基因共 28,375 个（25,444个上调，有2,931个下调）。 6.3 根据KEGG pathway 数据库注释信息共识别出12,412 个簇，与通路相关的差异表达基因230个，参与信号途径137个。与神经退行性疾病相关的基因有473个，差异表达基因3个。其中，与PD通路相关的基因118个，差异表达基因2个，表达均上调。 【结论】 1. 通过数据库分析筛选出miRNA15a/15b/16 和NUCKS1可能在PD的病理通路中存在调控作用，进一步在 PD 动物模型和 PD 细胞模型中确认miRNA15a/15b/16三者表达水平均下降而NUCKS1 mRNA表达水平上升，与数据库信息基本一致。 2. 在 SH-SY5Y 细胞中确认 NUCKS1 与 miRNA15a/15b/16 无显著调控关系。 3. NUSCK1基因敲除细胞致死。 4. NUCKS1基因在SH-SY5Y细胞中 knockdown后，激活了更多基因上调表达。GO 富集分析表明，差异表达基因以位于胞浆或胞外区为主，主要通过结合作用，发挥生物学功能。KEGG Pathway 分析表明，细胞因子结合作用通路、Jak-STAT 信号通路等与NUCKS1 基因缺失激活密切相关。与PD相关的差异表达基因(UBA7、UBE2L6)表达上调。二者共同参与的通路有 5 个。这为进一步揭示PD的病理进展的机制研究提供了依据，可能为PD的治疗研究提供一个新的视角。