未结合雌三醇(unconjugated estriol, uE3)的检测在孕妇孕期胎盘功能监测、唐氏综合征的筛查等方面发挥重要作用。孕妇血清未结合雌三醇的含量也可预示胎儿早产以及先兆子痫的可能性,也常用于非孕妇女肿瘤流行病学筛查、乳腺癌及宫颈癌的风险评估等。然而,目前常规测定uE3的方法如放射免疫法(RIA)、酶免疫法(EIA)、酶联免疫吸附法(ELSIA)、时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)、化学发光法(CLIA)等除精密度较差外,还存在抗原抗体反应固有的交叉反应导致的准确度欠佳和／或放射性危害等缺陷；更为重要的是,由于各测定方法的可比性差,直接影响了uE3的中位数倍数数据在唐氏综合征筛查中的可信度。目前国际上未结合雌三醇测定的参考方法为同位素稀释气相色谱-质谱联用法(ID-GC-MS),该法需要将样本进行较繁琐的衍生化过程,变成挥发性成分,因此会引入新的测定误差,增加了测量不确定度。导师之前建立的未结合雌三醇的质谱常规分析法用于评价两个常规化学发光系统,发现两个常规化学发光系统测定结果存在明显的系统误差。因此,建立未结合雌三醇测定的参考方法非常重要。另外,国内外均没有未结合雌三醇的参考物质,而且国外只有西门子公司采用小样本针对西方人群建立的参考区间,而无中国人群参考区间。在此背景下,本课题在已建立的未结合雌三醇常规ID-LC-MS法的基础上,对前处理条件、色谱条件、质谱条件进行全面研究,对方法学性能全面评价,建立更灵敏、更特异的候选参考方法。同时利用建立的候选参考方法进行具有互通性的人血清二级参考物质以及中国人群的参考区间研究,评定参考测量结果的不确定度,从而建成一套完整的未结合雌三醇检测参考系统。应用建立的参考系统对现行的常规化学发光检测系统进行评价,以期为未结合雌三醇测定标准化提供一个技术平台,也为其他激素的标准化提供参考。目的：优化同位素稀释-高效液相色谱串联质谱法(ID-LC-MS/MS)测定血清非结合雌三醇的前处理方法及各检测条件,为非结合雌三醇参考方法的建立提供基础。评价同位素稀释-高效液相色谱串联质谱法(ID-LC-MS/MS)检测未结合雌三醇候选参考方法是否满足参考方法具有最小不确定度的要求。应用建立的候选参考方法进行初步研究以形成完整的参考体系和标准化流程。方法：以活性炭吸附血清为研究基质,通过加入已知量的雌三醇标准品及雌三醇-2-3-4-12C3内标,在LC-20AD XR高效液相色谱系统和API 5500串联四级杆质谱仪上对非结合雌三醇的前处理中萃取条件、内标选择、离子抑制、平衡实验以及标准曲线基质效应、各种色谱条件、质谱条件等进行全面摸索和系统的优化。对初步建立的未结合雌三醇候选参考方法的主要性能：精密度、正确度、灵敏度、线性范围、干扰、方法特异性、携带污染等进行评估,评价其是否满足参考方法具有最小不确定度的要求。应用建立的候选参考方法调查了目前未结合雌三醇检测的主流平台的可比性情况,初步制备参考物质并评估其稳定性、互通性以及均匀性,建立成年男性、非孕女性和孕妇各孕周的参考区间,对ID-LC-MS/MS检测未结合雌三醇的测量不确定度进行评估,形成完整的评估流程。结果：质谱条件：选用ESI负离子模式和多反应监测(MRM)模式分析；定量离子通道选择质核比(m/z)287→145碎裂模式,m/z 287→171作为定性监测的离子转变。对应的内标离子转变为m/z 290→148(定量)和m/z 290→174(定性)。色谱条件：选用菲罗门C18填充的Knietex 100×2.1 mm,2.6 μm色谱柱,有机相为甲醇,水相为0.1 mM氟化铵溶液,自建T7梯度模式8min洗脱。前处理条件：正已烷/乙酸乙酯(50/50,v/v),样品与萃取剂的比例为1：2,萃取率可达85.71%；未观察到内标浓度引起的离子抑制效应；平衡时间选择30min；血清标准品与纯品标准品制备曲线未观察到明显基质效应。方法性能：候选参考方法在0.4-20.0 ng/mL浓度时,批内和批间精密度分别为0.45%-1.36%和0.66%-2.04%；标准品回收率99.2%,通过美国纽约州内分泌能力比对及国际参考实验室比对计划比对样本验证；LOD为0.04 ng/mL, LOQ为0.1ng/mL；线性范围为0.1 ng/mL-50ng/mL；方法特异性好,11种结构类似物仅16-表雌三醇和睾酮在检测条件下有响应,但对雌三醇的检测和定量没有干扰；血红蛋白610 mg/dL,胆红素20 mg/dL,甘油三酯3000 mg/dL条件下对方法没有干扰；方法携带污染率＜0.1%。方法应用：各常规检测系统跟候选参考方法之间结果可比性差,最高变异达37%；初步制备的血清参考物质均匀性及互通性好,冷冻条件下保存3个月稳定性变异<2%,赋值相对不确定度为2.48%,小于同类国际血清参考物质；成年男性及非孕女性未结合雌三醇参考区间为<0.1 ng/mL。结论：各种前处理条件、质谱条件、色谱条件得到充分优化,为ID-LC-MS/MS检测未结合雌三醇候选参考方法提供了基础条件,其中内外标准品的绝对添加及括号法标准曲线可能对改善方法性能有重要作用。初步建立的候选参考方法具有高于同类参考方法的精密度及分析灵敏度,具有准确分析的分段线性范围,抗干扰能力强,无携带污染以及100%的特异性。已基本形成一套围绕候选参考方法进行参考物质、参考区间、不确定度评定的标准化流程,为其他项目的标准化实践提供了参考。未结合雌三醇常规检测系统间可比性及溯源性差,参考实验室、参考方法、参考物质和参考区间组成的参考系统的应用是实现检验结果标准化的有效途径。