研究背景与目的:脓毒症是指由感染引起的全身炎症反应综合征,伴有脏器功能障碍,但其确切分子机制还不清楚,缺乏有效的治疗方法。巨噬细胞作为脓毒症促炎因子的主要来源,其代谢过程发挥着重要作用。巨噬细胞的糖酵解作为治疗靶点越来越受到人们的重视。本文研究了在小鼠盲肠结扎穿孔致脓毒症模型中,糖代谢重要中间产物之一乙酸对小鼠的保护作用及其作用机制。研究方法:1.在体观察乙酸对脓毒症小鼠的保护作用:采用小鼠盲肠结扎穿孔(CLP)脓毒症模型,观察在CLP术后30分钟分别腹腔注射乙酸250mg/kg或500mg/kg对小鼠7天生存率、CLP术后12小时肝和肺组织损伤、腹腔细菌清除率和小鼠血清促炎因子的水平。采用腹腔注射LPS建立小鼠内毒素血症模型,分别在建模前12天连续给予水中添加乙酸(150mmol/l)或建模前30分钟后给予乙酸腹腔注射(500mg/kg)预处理,检测小鼠血清促炎因子的水平。2.离体观察乙酸对巨噬细胞的作用:体外分离培养小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)、小鼠腹腔巨噬细胞、人外周血单核细胞(PBMC)、人类THP-1细胞和人CD14+细胞,分别用乙酸(5~100mmol/l)预处理0.5h、1h、2h后用LPS刺激,6h后检测小鼠血清促炎因子TNF-α和IL-6的水平。3.乙酸抑炎的机制探讨:首先,通过离体细胞进一步探讨乙酸对巨噬细胞免疫功能影响的机制。体外分离培养BMDM,将BMDM和RAW 264.7巨噬细胞系用乙酸(10mmol/l)预处理0.5h,在LPS(100ng/ml)刺激后15min、30min和60min收集细胞,采用Western Blotting法测定NF-κB p65、JNK、ERK和p38 MAPK磷酸化的改变。并用si RNA敲减GPR41、GPR43两个乙酸受体,检测小鼠血清促炎因子TNF-α和IL-6的水平。其次观察乙酸对糖酵解的影响。体外分离培养BMDM,用乙酸10mmol/l预处理后0.5h LPS刺激,LPS刺激后6h收集细胞与上清,测定BMDMs培养上清中乳酸浓度,分析2-NBDG摄取,检测细胞中糖酵解关键酶GLUT1,PFKFB3,HK2,MCT4m RNA的表达以及细胞酸化率(ECAR)和氧耗率(OCR)。随后通过γ-干扰素(IFN-γ)或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)预处理增强BMDM糖酵解后进一步观察乙酸对巨噬细胞糖代谢及促炎因子的影响。体外分离培养BMDM,用100ng/ml的IFN-γ或GM-CSF预孵育3小时,乙酸10mmol/l预处理后,LPS刺激6h,收集细胞和上清,ELISA法测上清TNF-α和IL-6的浓度;比色法测上清乳酸浓度;Q-PCR法测细胞GLUT1、HK2、MCT4、PFKFB3的m RNA表达;流式细胞仪分析细胞表面的GLUT1表达;Western Blotting分析测定NF-κB p65和m TOR磷酸化改变。4.乙酸如何抑制糖酵解:首先离体观察乙酸预处理对HIF-1αm RNA以及蛋白表达的影响。体外分离培养BMDM,用乙酸(10mmol/l)预处理0.5h,在LPS(100ng/ml)刺激后15min和30min,收集细胞,Q-PCR法测细胞的HIF-1αm RNA;Western Blotting法测定HIF-1α蛋白的表达。随后探讨HIF-1α是不是乙酸作用所必需的,我们在体内和体外用DMOG,一种HIF-1α脯氨酰羟化酶的竞争性抑制剂。将BMDM,先用DMSO或DMOG(0.5mmol/l)孵育2.5h,然后乙酸10mmol/l预处理0.5h,再用LPS100μg/ml刺激6h后收集上清,ELISA法测定上清TNF-α和IL-6水平。观察DMOG是否能反转乙酸降低LPS诱导的促炎因子的产生;Gl UT1、HK2、MCT4和PFKFB3的m RNA表达;巨噬细胞表面GLUT1表达;培养基中乳酸和葡萄糖的消耗率以及NF-κB的磷酸化改变。又将RAW264.7细胞,转染HIF-1α特异性载体和空白载体24 h后,观察过表达HIF-1α对乙酸降低LPS诱导的促炎因子的产生作用的影响。最后在体研究HIF-1α是不是乙酸保护脓毒症小鼠作用所必需的:将40只野生型(wild type,WT)C57BL/6小鼠随机分为假手术组(sham,n=8),CLP模型组(CLP,n=8),DMOG+CLP组(DMOG+CLP,n=8),乙酸处理组(CLP+A,n=8)和乙酸+DMOG组(DMOG+CLP+A,n=8)五个组。用DMOG(320mg/kg)腹腔注射2.5h,随后进行CLP术,然后用乙酸(500mg/kg,ip)0.5h,观察小鼠7天生存率;CLP模型后12小时收集小鼠肝肺组织、外周血血清、腹腔灌洗液。HE染色观察各组小鼠肝和肺的病理变化;ELISA法测外周血血清促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平等指标。结果:1.在体观察乙酸对脓毒症小鼠的保护作用:CLP组小鼠生存率为37.5%,乙酸处理组(250mg/kg、500mg/kg)的生存率分别为75%和85%,差异有统计学意义(P<0.05)。提示乙酸可明显改善CLP小鼠的生存率。CLP明显造成小鼠肝肺组织损伤,可见肝静脉、中央静脉和肝窦扩张淤血,肝小叶肝细胞萎缩和坏死,炎性细胞浸润、变性;肺小静脉和肺泡壁毛细血管扩张,充血和纤维组织增生;肝功能指标AST显著上升;腹膜细菌计数上升;血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高。与CLP组相比,乙酸处理组的肝肺组织损伤明显减轻,肝静脉、中央静脉和肝窦淤血,肝细胞坏死区域以及炎性细胞浸润显著减少;肺小静脉和肺泡壁毛细血管管壁重建增加,肺毛细血管充血和纤维化增生减少。乙酸处理组的AST明显下降,腹膜细菌计数显著降低;血浆TNF-α、IL-6、IL-1β水平下降(P<0.05)。提示乙酸可改善脓毒症造成的组织损伤,减少促炎因子的释放并增强病原体的清除能力。LPS诱导的小鼠内毒素血症模型结果显示,LPS能显著增加小鼠血清的TNF-α和IL-6,口服给药乙酸组或者腹腔注射给予乙酸组血清的TNF-α和IL-6明显下降,说明乙酸对LPS介导的体内促炎因子释放有抑制作用。2.离体观察乙酸对巨噬细胞的作用:在BMDM、小鼠腹腔巨噬细胞、人外周血单个核细胞(PBMC)、人CD14细胞以及人类的THP-1细胞中,LPS组的促炎细胞因子TNF-α和IL-6水平以及m RNA显著增加,乙酸处理组的TNF-α和IL-6水平以及m RNA较LPS组明显降低,提示乙酸对LPS诱导的TNF-α和IL-6释放和m RNA增加有抑制作用,且此抑制作用呈剂量依赖性和时间依赖性。在体外证实了乙酸的抑炎作用。3.乙酸抑炎的机制探讨:在BMDM,LPS组的NF-κB p65的磷酸化显著增加,而乙酸预处理导致激活的NF-k B p65显著减少。LPS组的JNK、ERK和p38 MAPK的磷酸化显著增加,然而,乙酸预处理的JNK、ERK和p38 MAPK的磷酸化与LPS组无显著差异。在BMDM,单独敲减GPR43和GPR41两个乙酸受体,或同时敲减GPR43和GPR41的表达,LPS组的TNF-α和IL-6显著增加,乙酸处理组的TNF-α和IL-6较LPS组明显降低;与乙酸组相比,无论单独敲减GPR43或GPR41的表达,还是同时敲减GPR43和GPR41的表达,TNF-α和IL-6的释放均无显著差异,提示GPR43和GPR41可能不涉及乙酸的抗炎作用。在BMDM,LPS组的血清乳酸水平、2-NBDG摄取略有增加,GLUT1、PFKFB3、HK2、MCT4 m RNA的表达迅速增加,巨噬细胞表面GLUT1表达明显增加;而乙酸处理组的血清乳酸水平、2-NBDG摄取降低,GLUT1、PFKFB3、HK2、MCT4 m RNA的表达显著下降,巨噬细胞表面GLUT1表达也显著降低。这表明,在BMDM中,乙酸抑制LPS诱导的糖酵解率和葡萄糖消耗率增加,提示在LPS刺激后,乙酸抑制糖酵解关键酶的表达。预孵育IFN-γ或GM-CSF增加BMDM的糖酵解后,相较LPS组,乙酸组的TNF-α和IL-6释放减少以及GLUT1,PFKFB3,HK2,MCT4 m RNA的表达降低;而预孵育IFN-γ或GM-CSF的乙酸治疗组,可见乙酸组的TNF-α和IL-6释放减少以及GLUT1、PFKFB3、HK2、MCT4 m RNA的表达降低几乎被完全反转。表明增加糖酵解能逆转乙酸的抗炎作用。在LPS诱导的内毒素血症模型中,乙酸处理组的小鼠脾巨噬细胞的2-NBDG摄取显著减少,说明乙酸在体内抑制LPS导致的葡萄糖摄取升高。4.HIF-1α在糖酵解中的作用:在BMDM,LPS组的HIF-1αm RNA和蛋白表达增加,乙酸组的HIF-1αm RNA和蛋白表达显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。表明在乙酸在m RNA水平和蛋白水平抑制LPS刺激引起的HIF-1α上调。用DMOG抑制BMDM的HIF-1α表达,结果显示,LPS组的TNF-α和IL-6显著增加,乙酸处理组的TNF-α和IL-6较LPS组明显降低,DMOG+乙酸组的TNF-α和IL-6与LPS组无显著差别。在RAW264.7细胞,通过转染HIF-1α特异性载体过表达HIF-1α,结果显示,LPS组的TNF-α和IL-6显著增加,乙酸处理组的TNF-α和IL-6较LPS组明显降低,而HIF-1α过表达+乙酸组的TNF-α和IL-6与LPS组无显著差别。说明HIF-1α是乙酸抑制LPS诱导的促炎因子释放所必需的。在BMDM,LPS组的GLUT1、PFKFB3、HK2、MCT4 m RNA表达明显升高,巨噬细胞表面GLUT1表达明显增加,乳酸产生和葡萄糖水平明显增加;乙酸组的GLUT1、PFKFB3、HK2、MCT4 m RNA的表达显著降低;DMOG+乙酸组的GLUT1、PFKFB3、HK2、MCT4 m RNA的表达显著降低,巨噬细胞表面GLUT1表达明显减少,乳酸产生和葡萄糖水平明显减少,与LPS组无显著差异。这表明乙酸降低LPS刺激产生的细胞因子至少部分通过HIF-1α依赖性的糖酵解的调节。在BMDM,LPS组的NF-κB p65磷酸化增加,乙酸组的NF-κB p65磷酸化显著降低;DMOG+乙酸组的NF-κB p65磷酸化增加,与LPS组无显著差异;证明DMOG能完全逆转乙酸抑制激活NF-κB的作用。最后在体研究HIF-1α是不是乙酸保护脓毒症小鼠作用所必需的:用DMOG在体内抑制脓毒症小鼠巨噬细胞的HIF-1α表达,与CLP组相比,乙酸组小鼠的死亡率显著降低,肝肺组织损伤明显减轻,肝静脉、中央静脉和肝窦淤血,肝细胞坏死区域以及炎性细胞浸润显著减少;肺小静脉和肺泡壁毛细血管管壁重建增加,肺毛细血管充血和纤维化增生减少。乙酸处理组的AST明显下降,腹膜细菌计数显著降低;血浆IL-6、IL-1β,TNF-α水平下降;而用DMOG预处理后,乙酸降低死亡率的作用明显反转,乙酸改善脓毒症造成的组织损伤,减少促炎因子的释放并增强病原体的清除能力也明显被反转。说明HIF-1α在乙酸引起的糖酵解改变中起关键作用。结论:乙酸可通过抑制LPS导致的HIF-1α表达来抑制LPS导致的糖酵解,进而减少促炎因子的释放,由此缓解脓毒症导致的脏器功能损害,提高其生存率。