锌离子影响朊蛋白错误折叠机制研究

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Prion疾病是一类由朊蛋白错误折叠所引起的可传染的致死性神经退行性疾病,在许多哺乳动物身上都有发生,包括疯牛病、羊瘙痒症和人克雅氏病。其发生机制通常认为是错误折叠的病理状态朊病毒蛋白PrpSc诱导细胞正常状态朊蛋白PrPC转变为PrPSc, PrPSc的积累会导致神经退行性疾病的发生。由于朊蛋白疾病可以像病毒一样具有传染性,因此人们把该疾病的传染源称作朊病毒。通过几十年的研究已证实,朊病毒的主要成分就是PrPSc,然而该领域还有许多悬而未决的问题,比如PrPc是如何向prpSc转变的?有哪些因素会影响PrPC的错误折叠?可引起不同病理特征的不同朊病毒株是如何形成和遗传的?由于锌离子和朊蛋白都能高度富集在神经突触间隙处,锌离子和朊蛋白可能具有重大的联系,因此本文以此为背景研究了锌离子影响朊蛋白错误折叠的分子机制。本论文的第一部分主要在体外研究了锌离子是如何影响朊蛋白的错误折叠的。prpSc在病人脑部可形成淀粉样纤维,在体外运用不同的手段也可以使重组的朊蛋白形成淀粉样纤维,并且它们具有很多相似的性质,因此常常用体外的方法研究蛋白的错误折叠。本文运用ThT荧光检测、Sarcosyl可溶SDS-PAGE实验,并结合透射电子显微镜观察的结果,发现人野生型朊蛋白的聚集可以分为四个阶段:无定形聚集、原纤维、成熟纤维和片段化的纤维;而在100μM锌离子存在的条件下人野生型朊蛋白则会快速形成不溶于Sarcosyl的寡聚体,然后形成短棒状的聚集体。本文通过圆二色光谱、傅里叶红外光谱、蛋白酶K酶解等方法,发现这两种聚集体的构象也不相同。而人朊蛋白八肽重复序列缺失突变体在0μM和100μM锌离子条件下都可以形成典型的纤维,并且构象没有明显的变化。等温滴定量热的实验证实了无论在生理条件还是在变性条件下,锌离子都是主要和朊蛋白的八肽重复序列结合。因此我们推测锌离子是通过和朊蛋白八肽重复序列相结合,使朊蛋白的柔性N端和球状C端相互作用,降低了朊蛋白的稳定性,从而导致朊蛋白以一种不同的方式聚集。接着,本论文的第二部分进一步在细胞内研究了锌离子对朊蛋白聚集的影响,通过Western检测、激光共聚焦荧光观察的方法发现200μM的锌离子可以使细胞内的朊蛋白聚集,通过免疫电镜的方法发现这些聚集体主要为寡聚体,形态上类似于体外获得的100μM锌离子条件下人野生型朊蛋白快速形成的寡聚体。通过引入高浓度的维生素c诱导细胞死亡,本文初步发现了锌离子所引起的朊蛋白聚集和细胞死亡的关系,细胞的死亡是锌离子所导致的朊蛋白聚集的必要而非充分条件。我们的实验具体研究了锌离子对朊蛋白聚集的影响,并阐释了其影响的机制。锌离子的异常可能会加速朊蛋白的聚集并改变朊蛋白的聚集途径,这对理解朊蛋白疾病的病理机制是有益的,锌离子还可能作为一种修饰机制改变朊蛋白聚集体的构象,可能对形成不同的朊病毒株有重要作用。
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