基因敲除或者敲入是研究基因功能最为有效的途径,在细胞或生物体基因组上进行高效、精确的编辑一直是限制该领域快速发展的瓶颈。传统的基于同源重组的基因打靶技术由于效率低、费用高等问题限制了其广泛应用。由于在特异位点引入双链DNA缺口(DSBs)可提高同源重组的效率,研究和开发能够在基因组特定位点进行切割的人工核酸酶就成为生物技术领域的关键问题。CRISPR/Cas9是继锌指核酸酶(ZFNs)和TALE核酸酶(TALENs)后可用于基因组高效编辑的第三代人工核酸酶。CRISPR/Cas9是RNA介导的核酸酶,能够通过替换sgRNA进行人为设计,实施靶位点特异性切割产生DSBs,激发细胞同源重组修复机制或者非同源末端连接修复机制,进而实现基因组的定点敲除、定点敲入和基因修饰。维生素D受体(Vitamin D receptor,VDR)是一种核转录因子,广泛存在于多种组织中,与活性维生素D3结合后被激活,通过调控靶基因的转录和刺激细胞内不同信号通路发挥着广泛的生物学作用。VDR主要功能是调节体内钙的平衡、抑制细胞增殖和刺激细胞成熟等,与许多疾病的发生有关,涉及皮肤、免疫系统、结肠、乳房和前列腺等多种组织。本论文以VDR为对象,根据CRISPR/Cas9设计原理,在人和小鼠VDR基因编码区保守序列筛选2个靶位点VDRT1和VDRT2,构建相应的CRISPR/Cas9打靶载体和报告载体。实验首先在人HEK293T细胞和小鼠C2C12细胞中进行了CRISPR/Cas9系统活性验证,最终通过受精卵显微注射法将VDRT1和VDRT2的sgRNA和Cas9 mRNA注射到小鼠受精卵,获得了VDR基因敲除的小鼠,并进行了部分相关功能的验证。另外,探索了通过活体睾丸直接注射慢病毒生产转Cas9基因小鼠的技术方案。(1)本研究通过网络在线软件设计并筛选了可用于人和小鼠VDR基因编码区VDRT1和VDRT2靶位点切割的2个sgRNA,采用引物直接退火方式,构建了2个CRISPRR/Cas9真核表达载体和相应的报告载体,报告载体的作用是为了精确检测打靶载体的活性和富集CRISPRR/Cas9作用了的阳性细胞。(2)将两套打靶载体和报告载体分别或者共同转入人HEK293T细胞和小鼠C2C12细胞,验证CRISPR/Cas9在VDR两个位点上的活性和对VDR基因大片段删除的能力。研究结果表明本研究所构建的CRISPR/Cas9系统在人VDRT1和VDRT2的效率分别为36%和31%,小鼠VDRT1和VDRT2效率分别为26%和22%。VDRT1和VDRT2的sgRNA可同时作用于基因组DNA实现VDR基因大片段敲除,效率为10%。(3)本研究通过显微注射法将sgRNA和Cas9mRNA注射到小鼠受精卵,获得了12只VDR敲除小鼠,双等位基因敲除效率66.6%,且有5只两个等位基因的indel完全相同。为了检测VDR敲除鼠的脱靶突变,通过网络在线软件预测6个潜在脱靶位点,发现在编码区OT1位点有4只敲除鼠存在脱靶,在非编码区的OT5位点均存在脱靶,其他位点并未检测到脱靶现象。(4)本研究通过qPCR和组织免疫荧光检测技术分析了VDR敲除鼠和野生型小鼠不同组织的VDR表达差异和VDR相关基因的表达差异。实验证明VDR基因广泛存在于各组织中,qPCR结果显示VDR基因转录水平在敲除鼠的多个组织中显著增加,但组织免疫荧光显示VDR在敲除鼠的各组织中没有表达,推测VDR表达可能存在一种负反馈调节机制。敲除鼠中VDR相关基因表达结果暗示VDR在不同组织中对相关基因的影响机制存在较大差异。VDR敲除鼠表型特征表明VDR功能的丧失影响骨骼和毛发的生长,还可能会影响到生殖能力。(5)本研究将携带eGFP和Cas9基因的慢病毒直接注射到小鼠睾丸曲精小管,借助慢病毒感染小鼠雄性生殖细胞,获得外源基因插入的精子,通过自然交配获得转基因个体。研究发现,不同的注射方法获得转基因个体的效率有较大差别,采用手术手段的曲精小管精准注射效率为50%以上,而通过非手术的随机多点注射方法的效率仅为12.5%。