论文部分内容阅读
目的:通过研究CD147在耐药肿瘤细胞中的作用,然后确定以CD147作为靶点,筛选CD147用于过继性细胞免疫治疗CTL的抗原表位,对野生型抗原表位进行改造,并在体外诱导出抗原特异性CTL,鉴定出具有抗耐药肿瘤功能的CTL抗原表位。为今后肿瘤相关抗原特异性T细胞过继性免疫治疗提供新的方法和靶点,也进一步为开发以CD147为靶点的TCR基因治疗药物提供一定的参考价值。方法:一、利用CRISPR敲除技术构建PX458-CD147敲除质粒,MTT法检测MCF-7/Adr敲除CD147前后耐药性以及IC50的变化,来研究CD147是否参与耐药肿瘤细胞耐药性的形成。二、利用经典的CTL表位在线预测系统BIMAS和SYFPEITHI对CD147蛋白序列进行CTL表位预测评分,寻找到与MHC分子低亲和力的野生型HLA-A2限制性9个氨基酸的抗原表位CD147126-134,对该9肽2位锚定残基进行点突变设计,通过对比突变前后的在线预测评分,筛选具有较高预测评分的突变肽,随后用T2细胞进行肽亲和力实验和MHC肽结合稳定性实验验证预测结果。三、用正常人PBMC,获取单核细胞并在体外刺激诱导出成熟的DC细胞,并用成熟的DC细胞体外分别负载野生型表位肽CD147126-134和突变肽CD147126-134L2体外与PBMC共培养刺激诱导出CTL。再用IFN-γELISpot和钙黄绿素法验证CTL对负载肽的T2靶细胞的识别,然后再用钙黄绿素释放实验检测CTL对四种不同的肿瘤细胞MCF-7/Adr(A2+,CD147high+)、MCF-7(A2+,CD147low+)、Hela（A2-,CD147+）、SKOV3（A2+,CD147-）的细胞毒作用,最后用HLA-A2抗体阻断实验来验证CTL对靶细胞的杀伤作用是否是以HLA-A2限制性的方式进行。四、提取实验组RNA,采用多重PCR技术进行多重基因分析方法并结合毛细管电泳检测CD147126-134L2表位肽刺激前后T细胞抗原受体（TCR）Vα和Vβ亚家族表达情况,研究抗原肽诱导的CTL中能识别突变肽CD147126-134L2抗原特异性T细胞的克隆增殖情况。结果:MCF-7/Adr耐药株用CRISPR技术敲除CD147后,相比于敲除前,耐药性显著降低;筛选到的野生型CD147126-134表位肽2位由突变为Leu后得到突变肽CD147126-134L2,并且突变肽CD147126-134L2与HLA-A2的亲和力和稳定性显著提高;IFN-γELISpot实验表明,突变肽CD147126-134L2诱导的CTLs不仅能够有效识别负载了突变肽CD147126-134L2的T2靶细胞,并且对负载了野生型肽CD147126-134的T2靶细胞同样具有相似的杀伤效果,表现出一定的交叉识别效应。钙黄绿素法检测CTLs对T2靶细胞的细胞毒作用可以看出,随着效靶比的逐渐递增,突变肽CD147126-134L2诱导的CTLs显示出了对负载了肽的T2靶细胞有效识别以及杀伤作用;通过CTLs对肿瘤细胞的杀伤结果来看,突变肽CD147126-134L2诱导的CTLs特异性识别CD147表达的肿瘤细胞,并且这种杀伤效果对高表达CD147的MCF-7/Adr最为显著,同时这也表明,野生型的CD147126-134表位肽虽然难以活化诱导出CTL但是仍然能够递呈到肿瘤细胞表面被突变肽CD147126-134L2诱导的CTLs交叉识别;HLA-A2抗体阻断实验表明,这种特异性杀伤是以HLA-A2限制性方式进行的;多重PCR结合毛细管电泳结果显示,Vβ2家族的这群T细胞发生了克隆性增殖。结论:CD147在耐药肿瘤中高表达相比于普通肿瘤细胞,并且其参与了肿瘤耐药性的形成。在随后的研究中我们成功利用点突变技术鉴定出了与HLA-A2分子有高亲和力的CD147突变表位肽CD147126-134L2,并且用DC负载肽的方法诱导出针对该表位肽的CTL,这种CTL对高表达CD147的耐药肿瘤细胞具有一定的杀伤作用,并且CTL中能识别突变表位肽CD147126-134L2的抗原特异性T细胞是一群以Vβ2为主的细胞。