雌激素和机械力都是调控骨改建的重要条件[1, 2]。由于绝经期妇女雌激素缺乏,具有骨代谢方面的特殊性,同时,与口腔应力负荷有关的牙周治疗、颞下颌关节病治疗、口腔修复和成人口腔正畸也日益普及,因而相应的临床与基础研究开始出现。口腔环境里,牙齿承担咀嚼功能,故而,牙槽骨及关节的骨改建中,力学影响不容忽视。雌激素和机械力在调节骨改建的过程中,均已有研究涉及到雌激素受体的介导作用,然而雌激素与机械力复合条件下,雌激素受体-α介导骨改建的机制究竟能否追溯到作为成骨细胞来源的骨髓间充质干细胞,至今仍有待于进一步的实验论证。本研究拟分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),经矿化成骨诱导液处理,在雌激素、流体剪切力等诱导条件下通过免疫组化、免疫蛋白印迹、实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)等方法观测雌激素受体的表达及活性。在阻断雌激素受体的情况下观察其成骨能力的变化。进一步还可以观察雌激素和流体剪切力对骨髓间充质干细胞的雌激素受体及成骨能力的影响是否具有协同性作用。研究内容如下:1.骨髓间充质干细胞的分离纯化培养鉴定为了获得相对均一的原代培养的大鼠骨髓间充质干细胞,本实验综合了密度梯度离心法[3]和全骨髓自然贴壁筛选法[4]的优点,从雌性SD大鼠股骨中分离、纯化培养出BMSCs,并通过倒置显微镜观察、MTT细胞生长曲线、克隆形成等生物学行为观察,初步判断其活力和均一性。再经过流式细胞仪对其表面标志物进行检测确定了其具有骨髓间充质细胞的阳性CD29和CD44表面抗原,同时由于表面抗原CD11b和CD45的阴性结果而排除了其为造血干细胞的可能。再经干细胞表面标志STRO-1阳性染色及成骨、成脂等多向分化诱导,获得了Von kossa染色的类成骨细胞和油红-O(Oil red O)染色的类脂肪细胞,从而正反论证、确认了所分离培养的细胞即为BMSCs。2.雌激素受体-α(ERα)在BMSCs中的动态表达本研究旨在观察BMSCs中的雌激素受体在成骨分化中的作用,故通过细胞免疫蛋白印记和免疫化学的方法确证了ERα在BMSCs细胞核的阳性表达。同时为了获得在成骨分化中ERα的信息,本实验又利用具有量化检测功能的实时荧光定量PCR技术(real-time PCR)对ERα的基因表达依BMSCs的培养阶段进行了动态观测,发现ERαmRNA会随细胞的增殖分化、基质分泌矿化等过程发生基因丰度水平的变化。在相当于增殖完成进入分化期时,基因丰度迅速达到平台期,并高位持续至成骨分化的矿化阶段。3.雌激素对BMSCs成骨分化的影响本实验目的是观察生理浓度的雌二醇(E2)能否增强经过矿化诱导的BMSCs的成骨分化效应。在不同浓度梯度的E2作用下,BMSCs的增殖和碱性磷酸酶(ALP)活性经MTT细胞生长曲线以及ALP活性测试等实验证明均有不同程度的提高,其中尤以10-6M的E2作用明显。再通过不同时间梯度发现在此浓度条件下,ALP表达增强并有时间依赖性。更重要的是,以上成骨效应在用雌激素受体阻断剂ICI182780处理后,均有明显降低,提示了雌激素受体在此过程中可能具有一定的中介作用。4.流体剪切力(FSS)对BMSCs成骨的影响本实验目的是观察在FSS的作用下,已经矿化诱导的BMSCs的成骨分化效应是否能得到增强。在不同梯度的FSS作用下,BMSCs碱性磷酸酶活性经ALP活性实验证明均有不同程度的提高,其中尤以12dyne/cm2作用明显。更重要的是,以上成骨效应在用ICI182780阻断雌激素受体后,均有明显降低,提示了雌激素受体在此过程中也具有一定介导作用。5.流体剪切力与雌激素双因素对BMSCs成骨效应的影响本实验目的是观察在FSS和E2双因素的作用下,已经矿化诱导的BMSCs的成骨分化效应是否得到增强。利用优化的12dyne/cm2 FSS复合10-6M的E2培养,ALP活性和核结合因子-1(Cbfa1)等成骨特征因子却呈现基因丰度的减低。应用此检测,ERα的基因丰度在刺激下无明显变化,提示二者对成骨分化没能表现出协同效应。总之,作为成骨源头的骨髓间充质干细胞在成骨分化上分别受雌激素和流体剪切力的促进,实验表明,雌激素受体尤其ERα在其中扮演了重要角色。而其具体作用通路和机制仍有待于进一步的研究证实。