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研究背景:乳腺癌是威胁全球女性健康的杀手,其术后复发和化疗效果不佳,是乳腺癌死亡率高的主要原因之一。乳腺癌干细胞(Breast cancer stem cells,BCSCs)被认为是其复发的根源,能够抵抗放射疗法且影响化疗的效果。乳腺癌干细胞因其具有自我更新能力、多向分化性、高致瘤性和对放化疗耐药等特性。成为近年来乳腺癌研究的热点。乳腺癌干细胞成为潜在治疗靶点。Hippo信号通路最初被发现是抑制增殖和促进凋亡来限制器官大小的信号通路。然而,许多证据表明Hippo信号通路可以调节干细胞和祖细胞自我更新和扩增。在乳腺癌、肝癌、非小细胞肺癌和子宫内膜癌发生进展中起作用。Hippo信号通路经过激酶级联反应,最终作用其核心转录因子TAZ/YAP,磷酸化的TAZ/YAP与14-3-3蛋白相互作用被阻断在细胞质中。并被泛素依赖的蛋白酶体降解。未被磷酸化的TAZ/YAP转移到细胞核中,与TEAD1-4或其他转录因子Smad、sp73等相互作用,诱导基因CTGF、AX1、BMP4等的表达,其中,以Hippo信号通路中核心因子TAZ/YAP表现最为明显。而在乳腺癌中,TAZ在影响乳腺癌干细胞成球、自我更新、分化则更加明显。辛伐他汀是HMG-Co A抑制剂,近几年研究表明辛伐他汀可以作为抗癌药对肿瘤起到抑制作用。研究表明辛伐他汀可以抑制Hippo-TAZ从胞质向胞核的转运,从而抑制TAZ在细胞核操控下游转录因子发挥生物学作用。紫杉醇是一种抗微管药物,促进微管蛋白聚合,抑制解聚,保持微管蛋白均一稳定,抑制癌细胞有丝分裂过程,作为乳腺癌、卵巢癌临床化疗的一线药物已经有很多年历史了,近年来,其药物效能减弱及耐药现象增加,辛伐他汀是否可以协同紫杉醇,增加其对肿瘤的药效还未曾报道。本研究选用辛伐他汀和紫杉醇对乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞侵袭、转移、EMT过程及对乳腺癌干细胞的影响,并探讨其有关作用机制。方法:实验分为四组:空白处理组、辛伐他汀处理组、紫杉醇处理组、辛伐他汀+紫杉醇处理组。(1)cck8检测肿瘤抑制率:各处理组的胰酶消化后将MDA-MB-231细胞按5×103/孔接种,24h后换用不同浓度药物梯度培养基(梯度),培养48h,CCK8避光加入,避光37℃孵育2h,用酶标仪测出OD值,应用Gradpad计算药物IC50。加入两种药物与之前单独测IC50时浓度梯度相同(两种药物添加比例1:1)48h后,测OD值。(2)划痕实验检测MDA-MB-231细胞迁移能力的变化:各处理组的MDA-MB-231细胞无血清培养48h,分别于0h以及48h时取样拍照,观察细胞迁移距离。采用Transwell实验检测各组MDA-MB-231细胞侵袭和转移能力的变化:各处理组细胞分别培养24h后取样拍照,并计数小室膜细胞数量。采用明胶酶谱检测各处理组MDA-MB-231细胞内MMP-2表达水平的变化。(3)Western blot技术检测MDA-MB-231细胞内蛋白水平的变化。检测指标包括:Hippo信号通路关键因子TAZ,干细胞标志物-OCT4、ALDH1。金属基质蛋白酶-2—MMP-2,E-钙粘素—E-cadherin,波形蛋白—Vimentin,凋亡通路相关蛋白—Bax、P53、Caspsase3、Bcl-2。免疫细胞化学技术观察细胞内TAZ、OCT4及E-cadherin、Vimentin蛋白表达情况。(4)流式细胞仪检测CD44+/CD24-染色检测各处理组干细胞比例。(5)干细胞成球实验检测各处理组成球能力及数量。(6)各组细胞药物处理48h后,每孔种植相同数量细胞培养,两周后,结晶紫色,观察克隆细胞群大小和数量。结果:(1)划痕及侵袭实验结果显示:辛伐他汀联合紫杉醇可以效地抑制其迁移距离及侵袭及转移数量。Western blot技术及明胶酶谱技术检测MMP-2的表达情况,结果显示:与空白对照组和单独加药组相比,辛伐他汀联合紫杉醇处理组MMP-2表达更显著下降。(2)通过对EMT标记物的检测发现:与空白对照组和单独加药组相比,辛伐他汀联合紫杉醇组升高E-cadherin的蛋白含量,降低细胞内Vimentin的蛋白含量。(3)凋亡相关信号通路的标记物检测结果显示:与空白对照组和单独加药组相比,辛伐他汀联合紫杉醇组,P53、Bcl-2、Caspsase3表达明显下降,Bax表达明显升高,克隆形成实验:(4)Western blot技术及免疫荧光化学技术检测结果显示:与空白对照组和单独加药组相比,辛伐他汀联合紫杉醇组,TAZ、OCT4、ALDH1蛋白表达明显下降,(5)流式细胞仪CD44+/CD24-染色检测干细胞比例及干细胞成球实验结果显示:空白对照组和单独加药组相比,辛伐他汀联合紫杉醇组更明显抑制乳腺癌干细胞比例及其成球能力。结论:辛伐他汀与紫杉醇联用可以抑制MDA-MB-231转移、侵袭,促进凋亡、抑制增殖。辛伐他汀与紫杉醇联用对乳腺癌干细胞通过下调Hippo-TAZ及其下游靶点Oct4对增殖与自我更新能力均有影响,或许可以对临床化疗提供新思路。