共培养紫锥菊不定根中生理活性物质积累及提取优化研究

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本试验以紫松果菊(Echinacea.purpurea Moench)与白色紫锥菊(Echinacea.pallida Moench)的共培养不定根为试验材料,在生物反应器内进行液体悬浮培养,通过测定培养基中的电导率和酸碱度及不定根的干重和总酚含量等变化情况,探明不定根生长及生理活性物质积累的动态变化规律,建立共培养不定根生长动力学模型;用茉莉酸甲酯(MeJA)和水杨酸(SA)作为诱导剂,促进目标物质在紫锥菊不定根中的积累;通过对不定根干燥温度、提取时间和乙醇浓度等调节因素与次生代谢产物含量的相关性分析,优化不定根活性物质提取工艺。研究与开发紫锥菊不定根生物反应器内共培养技术,为生产总酚和咖啡酸衍生物等生理活性物质提供一种新方法,为紫锥菊的合理开发利用提供新思路,可有效保护野生紫锥菊资源,同时促进紫锥菊中药的现代化发展。主要研究结果如下:(1)共培养紫锥菊不定根生长动力学模型的建立通过Pa+Pu共培养紫锥菊不定根,接种后的010 d,生物量提高较缓,次生代谢产物含量有所降低,这段时间为生长延滞期;1035 d,生物量急速提高且次生代谢产物的含量也大幅提高,培养至35 d时,生物量同次生代谢产物含量均可达到峰值,其收获的不定根干重为37.34 g,不定根中总酚含量为60.45 mg/g DW,这段时间为对数生长期;3550 d,生物量同次生代谢产物含量均保持稳定,无显著降低,这段时间为静止期。不定根生长和物质合成动态研究结果表明,共培养不定根中咖啡酸衍生物含量的变化与生物量相同,咖啡酸衍生物总量在延滞期保持不变甚至略有降低。从对数期开始,咖啡酸衍生物总含量急速升高,在第35 d达到最高为44.16 mg/g DW。培养基中的pH值随培养时间的增加而增加。EC与Fe2+螯合力的变化趋势一致,都随培养时间的增加而降低。DPPH和ABTS的变化趋势相似,在培养5 d之前是下降,之后是骤然升高,最后保持不变。还原力则随培养时间的增加先增加后降低。(2)诱导剂对共培养紫锥菊不定根体系中生理活性物质的影响通过添加MeJA和SA对紫松果菊与白色紫锥菊共培养不定根总酚及其产率的研究发现,MeJA的效果优于SA,因此在后续试验中选用MeJA作为诱导剂。当MeJA诱导剂添加浓度为25μM时,不定根中总酚含量及其产率均显著高于其他浓度处理的MeJA且不定根中咖啡酸衍生物总含量和PAL活性显著提高,总酚含量为80.86 mg/g DW。PAL活性在添加MeJA第24 h时达最高为24.03 U/mg,之后PAL活性逐渐降低至12.47 U/mg,同时POD和SOD活性均最高,因此25μM是添加MeJA的最佳浓度。当紫松果菊与白色紫锥菊的不定根共培养时,加入一定浓度MeJA能显著提高次生代谢产物的含量和产率。培养至30 d时添加MeJA的不定根总酚含量为81.28 mg/g DW(提高30.32%),因此30 d时是添加MeJA的最佳时期。(3)共培养紫锥菊不定根生理活性物质提取工艺的优化利用响应面法优化提取共培养紫锥菊不定根中的总酚含量。通过PB试验确定对其影响显著的5个因素,即提取时间、液料比、提取温度、乙醇浓度和提取次数。利用CCD法优化最佳提取条件并研究各因素之间的交互作用。结果表明,对不定根的提取率有显著影响的是提取温度*提取时间、提取温度*乙醇浓度和提取温度*液料比等因素的交互作用。通过CCD法所得模型计算最佳提取条件,即最佳提取温度为68.33℃,最佳提取时间为2.43 h,最佳乙醇浓度为56.56%,最佳液料比为91.49:1,此条件下总酚含量的估测值为63.37 mg/g DW,验证结果为65.84 mg/g DW。
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