近年来,鸡传染性支气管炎已成为继鸡新城疫、鸡马立克氏病、鸡传染性法氏囊病之后又一严重危害我国养禽业的烈性禽病,给养禽业带来了巨大的经济损失。膜蛋白(Membrane proein,M)是IBV的主要结构蛋白之一。M蛋白含224～225个氨基酸,占病毒蛋白总量的40%左右。据其糖基化程度的不同分子量为23ku～36ku。它是一种N连接低聚糖。M蛋白的主要功能是与病毒的组装、出芽有关,糖基化的M蛋白也与病毒的感染性相关,在补体存在的条件下也能诱导中和抗体的产生, M蛋白也可增强N蛋白的免疫性。因此,对IBV的M蛋白进行分子流行病学研究,可为鸡传染性支气管炎的防治提供理论依据。本研究从陕西省发病鸡群中分离出多株IBV,并对其M基因进行了相关研究:1.从临床表现呼吸道传染病的20个发病鸡群中先后分离出18株病毒,通过鸡胚感染、EID50的测定、血清学试验、分子生物学试验以及动物回归试验,证明18株病毒中的13株是冠状病毒科的鸡传染性支气管炎病毒,3株为新城疫病毒,2株为H9禽流感病毒。该13株中的BJ2、FF2、YL2、B01、G5、YX、WH、WG等8株分离毒具有很强的嗜肾性和致病力。中和试验表明,8个肾型IBV分离株的血清型与W118毒株相同,而与IBV Gray株、W93株有一定的差异。试验证实了,近年来陕西地区主要流行鸡肾型传染性支气管炎,且流行株具有强的嗜肾性和致病力。2.参照GenBank所收录的IBV M蛋白基因序列设计了一对引物,应用RT-PCR方法对8株陕西肾型IBV分离株的M基因进行了扩增,并构建克隆载体,经鉴定后将阳性质粒测序,并对测序结果进行核苷酸序列及氨基酸序列同源性和进化发生关系分析,对M蛋白的二级结构和跨膜区进行预测。结果表明,8分离株中除YX和WH株外,其余6株的M基因都有BamHI酶切位点;分离株间的M蛋白核苷酸和氨基酸同源性分别为92.3%～99.8%和95.4%～100%,与参考毒株的M蛋白核苷酸和氨基酸序列同源性分别为87.4%～99.5%和89.4%～99.5%;分离株与参考毒株M蛋白的α-螺旋结构都主要分布在N端前100氨基酸肽段区,其它的部分主要是β-折叠和无规则卷曲结构;分离株的M蛋白都包含有3个跨膜区,主要分布在N端17～37,41～63,74～93aa肽段区。试验证实IBV分离株M蛋白在基因序列和二级结构上相对保守,M蛋白与IBV的血清型无关,但M蛋白可用于鸡传染性支气管炎与其他疫病的鉴别诊断。3.以陕西8个AIBV分离株M蛋白的基因序列为基础,应用DNAStar软件中的MegAlign模块对其进行同源性分析;用Kyte-Doolittle方案、Jameson-Wolf方案、Karplus-schulz方案、Plot-Emini方案和Gamier-Robson方案对其中4个代表毒株的M蛋白B细胞抗原表位和二级结构进行了综合预测。结果显示,分离株间以及它们与AIBV H52、M41、SAIB20、LX和Gray株的同源性相对较高,8株的M蛋白主要在10～40aa和90～175aa处存在无规律的点突变。4个代表株(W118、WH、YL2、YX)的M蛋白B细胞优势抗原表位都在159～164aa和181～193aa肽段区(该2个区域都包含了无规则卷曲和β-转角结构)或其附近。结果表明分离株的M蛋白相对保守,只存在无规则的点突变,该变异对AIBV M蛋白B细胞表位的稳定性无影响。4.以IBV陕西分离株G5(W118)作为研究材料,将所构建的表达载体pET28a-M转入大肠杆菌BL21(DE3),通过表达条件的优化探讨M蛋白高效表达的方法,并应用SDS-PAGE和Western-blot对表达产物进行鉴定。结果表明,目的蛋白在表达温度为25℃、诱导剂工作浓度为0.5mmol/L、卡那霉素工作浓度为80μg/mL、诱导前菌体OD600≈1.5的条件下成功地得到了表达,融合蛋白的分子量为30.5ku,蛋白表达量可占菌体蛋白总量的20%左右。这为IBV M蛋白的进一步研究奠定了基础。本研究通过对陕西省鸡IBV的分离鉴定、M蛋白基因序列分析、M蛋白的B细胞抗原表位和二级结构预测分析以及M蛋白的高效表达,为我国鸡传染性支气管炎的防治提供了新的物资材料和理论资料。