促红细胞生成素(EPO)是一种由肾脏分泌的调节红细胞生成的糖蛋白激素。基因工程产品重组人促红细胞生成素(rhEPO)已广泛用于临床，治疗各种类型的贫血，为贫血患者带来了福音。但这种药物存在的问题是药效短，用药次数多，给患者带来不便。长效促红细胞生成素(LL-EPO)即是为克服此问题而研制开发的新产品。同位素标记示踪法是目前生物制品临床前动物药代动力学研究的主要手段之一，而制备高纯度的同位素标记物是应用该方法进行药代动力学研究的关键和首要条件之一。本试验的目的就是对LL-EPO的标记、纯化方法等进行研究，并对其生物活性进行鉴定，以制备高纯度的LL-EPO同位素标记物，为研究LL-EPO的药代动力学提供必要条件和保证。 针对文献报道的双相氯胺-T法所面临的实验器材制作比较复杂，对技术要求较高，需将离心管的上端切去，并将管口烫平(很难做到且不易规范化)等问题，本研究对文献报道的双相氯胺-T法加以改进，并选用放射性碘-125作为标记核素对LL-EPO进行标记。另外，为克服凝胶过滤层析方法进行LL-EPO标记物纯化之费时、费力，纯化后标记蛋白浓度低，蛋白定量困难，蛋白回收率低等不足，首次进行了离心超滤法分离纯化LL-EPO标记物的研究，并对标记纯化的LL-EPO经三氯乙酸沉淀和SDS-PAGE法鉴定放化纯度，通过网织红细胞法对标记前后的蛋白生物活性进行鉴定。同时比较了双相氯胺-T法和常规氯胺-T法标记LL-EPO、凝胶过滤和离心超滤法分离纯化标记蛋白的效果；并初步探讨了温度对标记蛋白放化纯度的影响。取得的结果如下： 1．对文献报道的双相氯胺-T法进行了如下改进，包括选择带盖的小反应瓶，并对其进行硅烷化处理；将产生氯气的滤纸直接悬在反应瓶中。从而使该法在保持原有特点(如反应温和、标记充分、标记物比放射性高、常温下进行、条件易于控制等)的同时，还具实验器材制作简单、容器表面的蛋白吸附减少、氧化剂的浓度可以灵活调整，反应体系密封性更好等优点。 2．改进的双相氯胺-T法标记LL-EPO，其标记率为89％，比放射性为5.82×10~5Bq μg蛋白，均比常规氯胺-T法高(其标记率和比放射性分别为20.65％，3.62×1.0~5Bq μg蛋白)，三氯乙酸沉淀法测得的放化纯度＞96％，SDS-PAGE法鉴定标记产物同原型蛋白电泳行为一致，有两个电泳条带，Rf值分别为0.28、0.49。网织红细胞法鉴定的标记蛋白与原型药物的生物活性无差异。所得标记蛋白满足同位素示踪法研究药代动力学的要求。 3．离心超滤法分离纯化标记蛋白，与通常应用的凝胶过滤纯化法进行了比较。结 果离心超滤法得到的蛋白回收率为95％以上，而凝胶过滤法得到的蛋白回收率仅为。23．82％：前者得到的标记蛋白浓度高侣 ＊后者浓度仅为1．81Vg／thl。 4．温度对碘标记LL卫PO的放化纯度有明显影响。常温保存的标记LLEPO放化 纯度下降幅度比4’C保存的大，前者从第3天开始放化纯度即有明显下降，而后者在5 天之内放化纯度保持在较高水平，5天之后才有较大幅度的下降。 结论： ！．改进的双相氯胺1法操作简单，容器表面的蛋白吸附少、氧化剂的浓度可以灵 活调整，反应体系密封性好：反应温和，标记充分，常温下进行，条件易于控制；标记 效率高；对蛋白生物活性影响小。 2．离心超滤法可以用于标记蛋白的分离纯化，其优点是操作简单，省时、省力， 标记蛋白浓度高，蛋白回收率高。