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研究背景:肺癌是癌症相关死亡的第一位原因,而且是近年来发病率上升最快的肿瘤之一。发达国家中肺癌病人总的5年生存率在过去的几十年间始终徘徊在10%左右。肺癌患者预后不良的一个重要原因是其具有容易复发和远处转移的特性。临床资料表明,即使是IA期的患者在肿瘤完全切除后也大多死于复发和转移。因此,深入阐明肺癌发生、发展的机制,尤其如何预防、治疗肺癌的复发和转移是改善病人预后的关键,也是近年来研究的热点之一。MicroRNA(miRNA)是近年发现的、小的、不具有蛋白质编码功能的RNA。其主要生理功能包括调控细胞和器官的生长、发育;调节细胞增殖和凋亡;参与代谢和应激反应等。现已明确miRNA是通过在转录和(或)翻译水平负调控靶基因而发挥各种生理、病理作用。研究提示miRNA可能参与调控肿瘤的发生、发展,包括侵袭与转移;其机制可能与miRNA和各种信号传导通路的相互作用有关。然而,该方面的工作还处于起步阶段,需要深入、全面地研究;而且,截止目前未见有关miRNA与肺癌转移关系的研究。研究目的:1了解miRNA是否参与肺癌侵袭与转移的调控;2了解miRNA调控肺癌侵袭与转移的分子机制;3了解肺癌细胞中miRNA的表达是否与表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)信号通路的活化有关;4探讨EGFR信号通路相关的miRNA的功能。研究方法:1应用miRNA芯片和实时定量RT-PCR了解高、低转移巨细胞肺癌细胞801D和95C之间miRNA的差异表达以及筛选EGFR信号通路相关的miRNA;2 miRNa的功能分析Transwell Insert、体外划痕愈合实验、微管形成实验、增殖和凋亡分析、细胞周期分析等了解miRNA对肺癌细胞生物学行为的影响。3生物信息学方法预测及Western Blot和荧光素酶报告基因试验验证其对靶基因的调控作用。4基因芯片检测及Gene Otology(GO)分析miRNA对肿瘤转移相关基因表达的影响;研究结果:1巨细胞肺癌细胞中miR-183的表达MiRNA芯片检测显示在高转移巨细胞肺癌细胞801D和低转移巨细胞肺癌细胞95C之间共有92个miRNA的表达存在显著差异。其中miR-183是差异最明显的miRNA之一。实时定量RT-PCR证实801D细胞中miR-183的表达水平明显低于95C。2 miR-183对肺癌细胞的迁移和侵袭能力的影响Transwell Insert实验显示801D细胞转染miR-183后,迁移的细胞数和侵袭的细胞数都明显较对照组减少。体外划痕愈合实验也显示转染miR-183后801D细胞的创伤愈合能力降低,自划痕24小时后达到统计学意义。3荧光素酶基因报告实验及荧光素酶活性测定3个最常用的数据库(TargetScan,PicTar and miRanda)均预测Ezrin蛋白的编码基因VIL2可能是miR-183调控的靶基因。Western Blot结果证实转染外源性miR-183可以完全抑制801D细胞Ezrin蛋白的表达。为了探讨miR-183是否是否直接调节Ezrin表达,我们将含有miR-183结合位点的VIL2 mRNA 3’UTR序列克隆并连接入荧光素酶基因报告载体pGL3中。将该重组质粒和miR-183共转染到801D细胞,结果显示miR-183可以明显抑制重组质粒的荧光素酶活性。4 Affymetrix芯片检测及GO分析结果Affymetrix U133 plus 2芯片检查发现共424个基因mRNA的表达受miR-183影响:其中258个下调,166上调。功能分类结果表明9.69%(25/258)的下调基因和7.23%(12/166)的上调基因分别与细胞黏附、迁移、侵袭和转移有关。其中包括具有促乳腺癌细胞转移的CCL5;可以促进黑色素瘤转移的CTHRC1以及与胃癌转移相关的CYR61等。5 EGFR信号通路相关miRNA的筛选及验证结果用P值＜0.01做为表达差异的筛选标准,表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)刺激后肺癌细胞中共有39个miRNA表达发生明显改变:9个上升、30个下降。其中的5个miRNA—let-7i、miR-24、miR-25、miR-29b和miR-125a-5p的表达能被gefitinib(EGFR酪氨酸激酶抑制剂)逆转。因此,我们推测该5个miRNA可能与EGFR信号通路相关。实时定量RT-PCR检测显示:除let-7i外,其余4个miRNA的表达均明显受EGF刺激的影响(miR-25、miR-29b表达升高;而miR-125a-5p和miR-24表达降低),且能被gefitinib逆转;其中以miR-125a-5p改变最明显。6 miR-125a-5p的功能分析结果转染miR-125a-5p抑制物后PC9细胞的增殖能力、迁移、侵袭细胞数明显较阴性对照和空白对照组增加;同时明显促进脐静脉内皮细胞的血管形成能力;而对PC9细胞的凋亡、细胞周期无明显影响。结论:1高、低转移巨细胞肺癌801D和95C之间miRNA表达谱存在显著的差异;801D细胞中miR-183的表达明显低于95C细胞;2 miR-183可能参与肺癌转移的调控;其作用机理可能为抑制Ezrin蛋白表达:3 miR-125a-5p、miR-25、miR-29b和miR-24等的表达水平受EGFR信号通路活化的调控;4 miR-125a-5p的表达与PC9肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭及脐静脉内皮细胞的血管形成能力负相关。