人羊膜间充质细胞诱导成骨修复兔牙槽突裂的实验研究

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目的:通过对人羊膜间充质细胞(hAMCs)体外诱导分化为成骨细胞,经明胶海绵搭载移植修复兔牙槽突裂,为牙槽突裂组织工程修复寻找理想的种子细胞来源。   方法:采用手术方式在兔上颌骨制造一个1.0 cm×0.5cm楔状缺损,建立兔双侧牙槽突裂模型。采用机械法和酶分离法从人羊膜组织中分离出hAMCs,并进行体外培养,第三代细胞用流式细胞仪(FCM)分别检测表面分子CD44、CD29、CD45、CD34、CD166和CD71的表达情况,并采用免疫细胞化学方法检测波形蛋白进行细胞表型鉴定。对鉴定为hAMCs的第三代细胞加入DEX、VitC和β-GP进行定向诱导,使其向成骨细胞分化,21天后用茜素红S检测钙盐沉积判定其是否向成骨细胞分化。将认定分化成成骨细胞者应用到动物实验中。根据移植物的不同将建立的牙槽突裂兔随机分为A组(hAMCs与明胶海绵复合体;n=12)、B组(经诱导后hAMCs与明胶海绵复合体;n=12)、C组(单纯明胶海绵移植;n=12),D组(空白对照;n=4)。于移植后2w、4w、6w、8w、12w处死各实验组2只实验动物,D组实验结束时一并处死。对移植区牙槽骨的厚度进行测量,常规HE染色及免疫组化染色以观察移植区新骨形成及细胞存活情况。   结果:①第三代的hAMCs呈长梭形,漩涡样生长,表达CD29、CD166、CD44、CD73、波形蛋白,不表达CD34、CD45,并能很好的粘附生长于胶原一明胶海绵上;②经地塞米松、维生素C和β-甘油磷酸钠,诱导21天后可检测出茜素红染色阳性的钙结节;③经手术移植后2w、4w、6w、8w、12w处死各实验组2只兔,12w大体标本示:A、B两组牙槽突缺损处大量骨质沉积,缺损处得以修复,C组:骨面粗糙,缺损处有骨质充填,缺损变小,变浅;D组:缺损变小,内侧见薄层骨质充填,中切牙牙根暴露或仅有少许骨质包绕。12w后在移植区牙槽骨厚度比较,A与B组,P>0.05;A与C、D组比较,P<0.05,B与C、D组比较P<0.05,C与D比较P<0.05。④ HE染色:A,B两组在术后2W可见成骨细胞聚集区,但B组出现钙盐沉积较A组早,C组各个时期均未发现成骨细胞聚集区。⑤移植后12周A组与B组经免疫组化检测到抗人细胞核抗体的细胞存在,C、D组未检测到抗人细胞核抗体的细胞。   结论:1、hAMCs表达典型的间充质干细胞的表面标志,可以在体外诱导成骨;   2、hAMCs及诱导成骨后都可以很好的生长于胶原-明胶海绵;   3、hAMCs及成骨诱导后的hAMCs均可在体内成活;   4、hAMCs可在体内分化骨,但其体内分化的机制、植入细胞存活率、分化率、转归还有待进一步研究;   5、hAMCs有望成为组织工程修复牙槽突裂地种子细胞。
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