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紫杉醇是最早从红豆杉植物中发现的一种对肿瘤细胞具有抗癌活性的次级代谢产物,具有独特的抗癌机制,目前主要用于晚期和转移性卵巢癌、转移性乳腺癌和非小细胞型肺癌的治疗,同时发现对其他的多种癌症都具有良好的治疗效果。由于紫杉醇的生产方法效率低下,同时癌症患者人数与日俱增,目前生产出的紫杉醇远远不足以治疗庞大的癌症患者人群,需要对紫杉醇生产方法进行深入的研究,缓解紫杉醇严重短缺的现状。通过从红豆杉属及其他种属植物中分离得到的内生真菌进行发酵培养来生产紫杉醇是一种很有前途的方法,虽然目前国内外已经分离出了很多种属的具有紫杉醇合成能力的内生真菌,但是发酵液中的紫杉醇都达不到毫克级别,不能用于工业化生产,所以需要对分离的菌株进行更加深入、全面的研究。本实验室从西北农林科技大学博览园中曼地亚红豆杉的茎中分离得到一株具有紫杉醇合成能力的内生真菌,其产量在PDB培养基中最高可以达到696.24μg/L,经形态学方法和分子生物学方法鉴定为曲霉属烟曲霉真菌,将其命名为Aspergillus fumigatus TMS-26。由于PDB培养基是一种天然培养基,成分是不稳定的,导致在前期的发酵中A.fumigates TMS-26产量也很不稳定,所以寻找一种能稳定高产紫杉醇的合成培养基是很必要的。主要研究内容如下:1、首先对A.fumigates TMS-26的发酵过程检测生物量、葡萄糖消耗量和紫杉醇产量,发现A.fumigates TMS-26在基础发酵培养基中,发酵14 d的时候,紫杉醇产量达到最大,为0.660±0.016 mg/L,所以后期选择发酵周期为14 d;对碳源、氮源进行单因素试验优化,发现最适合A.fumigates TMS-26生长的碳源和氮源分别是葡萄糖和NH4NO3,而最适合A.fumigates TMS-26合成紫杉醇的则是甘油和NaNO3。2、对12种无机盐进行单因素试验,发现这些无机盐均能在适量的浓度下促进A.fumigates TMS-26生产紫杉醇,其最适合的浓度分别为KH2PO4 5 mmol/L、MgSO4 3mmol/L、Na2HPO4 3.5 mmol/L、CaCl2 0.01 mmol/L、ZnSO4 1.2 mmol/L、苯甲酸钠0.06mmol/L、AgNO3 0.09 mmol/L、CoCl2 0.2 mmol/L、CuSO4 0.02 mmol/L、FeSO4 0.025mmol/L、FeCl3 0.025 mmol/L、乙酸钠0.09 mmol/L。3、对12种无机盐进行Plackett-Burman试验,筛选出FeSO4、CoCl2和Ag NO3三种重要的无机盐;然后进行最陡爬坡试验,使FeSO4、CoCl2和AgNO3取值浓度接近最大影响面区域;最后通过Box-Behnken试验设计,对这三种无机盐进行试验,并建立响应面模型,预测最佳值,得到了FeSO4、CoCl2和AgNO3的最优取值分别为0.035 mmol/L、0.032 mmol/L和0.012 mmol/L。最后得到最优的发酵培养基成分为甘油0.6 mol/L,NaNO30.1 mol/L,FeSO4 0.035 mmol/L,CoCl2 0.032 mmol/L,AgNO3 0.012 mmol/L,pH=6,对优化的培养基进行验证,发现紫杉醇的产量达到0.731±0.007 mg/L,与预测结果基本一致。通过响应面试验优化,不仅得到了一种能稳定生产紫杉醇的合成培养基,并且产量提高了14.8%。