目的:急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是世界上最严重的致残致死性疾病之一。及时进行再灌注治疗恢复缺血心肌的血液供应,被认为是阻止心肌坏死最有效的治疗手段,但再灌注治疗本身可能导致心肌损伤程度的加重,即发生心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)。这种损伤的加剧主要表现为心肌顿抑、严重致死性室性心律失常、冠脉无复流甚至心肌梗死面积进一步增加等,严重威胁着患者的生命。MIRI发生的过程较为复杂,可能涉及多种机制,如氧化应激、钙超载、细胞凋亡和能量代谢障碍等。线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)是线粒体上的一种跨膜结构,其不可逆开放会造成线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,△Ψm)下降,从而激活线粒体凋亡通路,导致细胞凋亡。研究发现,MPTP在心肌缺血期间保持关闭,但在再灌注早期开放,此为发生MIRI的重要机制之一。在缺血前或缺血后给予MPTP开放的特异性抑制剂环孢素A(cyclosporin A,CsA),已经在多项动物实验和临床研究中被证实能够通过阻断MPTP的开放从而减轻MIRI。因此,寻找有效的药物及干预手段来抑制MPTP开放成为防治MIRI的一个重要切入点。桑黄素(morin)是一种天然的黄酮类化合物,具有多种药理作用,如抗氧化、抗炎和抗凋亡等,能够清除活性氧(reactive oxygen species,ROS)、抑制脂质过氧化并且提高各种抗氧化酶的活性。由于桑黄素能够清除ROS从而降低其水平,因此我们推断桑黄素能够通过抑制MPTP的开放进而减轻MIRI。综上所述,本研究旨在明确桑黄素对心肌缺血再灌注损伤的作用,以大鼠H9c2心肌细胞及大鼠离体心脏为研究对象,通过构建心肌细胞缺氧复氧模型及离体心脏缺血再灌注模型,研究以下两部分内容:(1)观察并比较正常组和桑黄素预处理组细胞缺氧复氧损伤以及离体心脏缺血再灌注损伤的差异,明确桑黄素是否对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用;(2)观察并比较正常组和桑黄素预处理组大鼠心肌细胞和心肌组织中MPTP开放的情况、MPTP下游凋亡通路的激活以及MPTP开放相关调控因子的表达情况,并应用MPTP开放的特异性激活剂苍术苷(atractyloside,ATR)进行干预,观察其能否减弱桑黄素对心肌缺血再灌注损伤的保护作用,以揭示桑黄素发挥心肌保护作用的关键性靶点及可能机制。研究方法:1、将正常条件(37℃、5%CO2)下培养的H9c2心肌细胞更换无糖Earle’s培养基后,放入三气细胞培养箱中于低氧条件(37℃、5%O2、5%CO2、90%N2)下培养12h,之后再更换正常完全培养基于正常条件下培养1h,以制备心肌细胞缺氧复氧模型。正常组细胞不给予药物处理;缺氧复氧组细胞给予缺氧复氧处理;溶剂组细胞于细胞缺氧复氧处理前12h给予0.1%DMSO干预;桑黄素预处理组细胞于细胞缺氧复氧处理前12h给予梯度浓度(12.5μM、25μM、50μM)桑黄素干预。苍术苷以20μM的浓度联合相应浓度桑黄素于细胞缺氧复氧处理前12h给予细胞预处理。2、应用Langendorff离体心脏灌流系统通过全心缺血30min、再灌注60min来制备大鼠离体心脏缺血再灌注模型。缺血再灌注组大鼠不给予药物处理;溶剂组大鼠于心脏离体前5日开始,每日给予腹腔注射桑黄素溶剂,即10%PEG400;桑黄素预处理组大鼠于心脏离体前5日开始,每日给予腹腔注射梯度剂量(10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg)桑黄素。苍术苷以5mg/kg的剂量于心脏离体前30min予相应剂量桑黄素预处理组大鼠腹腔注射。3、CCK8法检测心肌细胞活性。4、台盼蓝染色检测心肌细胞存活率。5、LDH测定评估心肌细胞损伤。6、流式细胞术检测心肌细胞凋亡率。7、于心脏停灌前灌流平衡阶段、再灌注30min以及再灌注60min时监测心率和冠脉流量。8、HE染色观察大鼠心肌显微结构变化。9、TTC染色观察大鼠心肌梗死情况,并计算心肌梗死百分比。10、钙诱导法检测心肌MPTP开放情况,并计算min/maxA540。11、JC-1染色检测心肌细胞线粒体膜电位变化。12、Real Time PCR检测MPTP下游凋亡通路以及MPTP开放相关调控因子的mRNA表达变化。13、Western blot检测MPTP下游凋亡通路以及MPTP开放相关调控因子的蛋白表达变化。14、TUNEL法检测心肌凋亡情况,并计算心肌凋亡率。15、统计分析:两组间比较应用独立样本t检验,多样本多组间比较应用单因素方差分析,若组间存在统计学差异则进一步采用LSD检验进行组间两两比较。P<0.05认为差异有统计学意义,P<0.01认为差异有显著统计学意义。结果:1、各桑黄素预处理组的细胞活性均显著高于缺氧复氧组。各桑黄素预处理组的细胞存活率均显著高于缺氧复氧组。各桑黄素预处理组细胞的LDH活性均显著低于缺氧复氧组。各桑黄素预处理组细胞的凋亡率均显著低于缺氧复氧组。2、各桑黄素预处理组于再灌注30min和60min时的心率和冠脉流量均较缺血再灌注组显著恢复。各桑黄素预处理组大鼠心肌显微结构的损伤程度较缺血再灌注组均有不同程度的减轻。各桑黄素预处理组大鼠心肌梗死百分比较缺血再灌注组也显著下降。3、20mg/kg桑黄素预处理组大鼠心肌线粒体对钙诱导MPTP开放的敏感性较缺血再灌注组显著下降,min/maxA540显著高于缺血再灌注组。25μM桑黄素预处理能够显著抑制缺氧复氧细胞线粒体膜电位的下降。4、25μM桑黄素预处理组的心肌细胞中,Cytochrome C、apoptotic protease activating factor-1(APAFl)、Caspase9 和 Caspase3 的 mRNA 和蛋白表达水平分别较缺氧复氧组均显著降低。20mg/kg桑黄素预处理组的心肌组织较缺血再灌注组相比,结果也呈现相同的趋势。5、25μM桑黄素预处理组的心肌细胞中,Bax的mRNA和蛋白表达水平较缺氧复氧组均显著降低,而Bcl2的mRNA和蛋白表达水平较缺氧复氧组均显著升高。同时,无论在mRNA还是蛋白表达水平,二者的比值Bax/Bcl2均较缺氧复氧组显著降低。20mg/kg桑黄素预处理组的心肌组织较缺血再灌注组相比,结果也呈现相同的趋势。6、应用苍术苷干预后,大鼠心肌线粒体对钙诱导MPTP开放的敏感性较桑黄素预处理组增加,min/maxA540显著低于桑黄素预处理组,并且桑黄素预处理对缺氧复氧细胞线粒体膜电位的下降的抑制作用也被抵消。与桑黄素预处理组相比,应用苍术苷干预后的心肌细胞和心肌组织中Cytochrome C、APAF1、Caspase9和Caspase3的表达水平分别较桑黄素预处理组均显著升高;Bax的表达水平显著升高,Bcl2的表达水平显著降低,二者的比值Bax/Bcl2显著升高。苍术苷联合桑黄素预处理的缺氧复氧细胞活性及生存率较桑黄素预处理组细胞显著降低,并且LDH活性及心肌细胞凋亡率显著增加。苍术苷联合桑黄素预处理缺血再灌注大鼠后,其心肌显微结构的损伤程度较桑黄素预处理组大鼠更为严重,并且其心肌梗死百分比及心肌凋亡率显著增加。结论:1、桑黄素可以有效减轻大鼠MIRI。2、桑黄素通过调节Bax和Bcl2,抑制MPTP开放及其下游凋亡通路的激活,从而减轻MIRI。