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目的:子宫内膜癌是位居第四位的导致女性死亡的恶性肿瘤,在子宫内膜癌肿瘤发生发展的血管生成过程中,过度表达的Tie2基因起到非常重要的作用,为了更好的研究Tie2基因在恶性肿瘤发生发展中的作用,我们采用RNA干扰技术敲除Tie2基因,降低Tie2基因的转录及表达,以研究其功能。
方法我们将表达Tie2-siRNA的碱基片段插入含有CMV启动子、新霉素抗性基因及绿色荧光蛋白报告基因的质粒中,应用脂质体包涵体技术将质粒转染入子宫内膜癌Ishikawa细胞株,以减少Tie2基因的表达。随后借助绿色荧光蛋白报告基因及新霉素抗性基因筛选出稳定表达单克隆细胞株,并采用逆转录PCR及蛋白印迹方法鉴定。成功获得稳定表达单克隆细胞株后,用MTT实验描绘各组细胞增殖曲线,DAPI染色及流式细胞术检测各组细胞凋亡,Transwell实验估测细胞侵袭能力,不同浓度卡铂处理细胞检测各组细胞的化疗敏感性。
结果成功筛选出表达Tie2-siRNA的稳定表达单克隆细胞株,其Tie2基因的mRNA转录水平及蛋白表达水平抑制率分别为77%及59%,研究发现,Tie2-siRNA组细胞生长增殖能力下降,凋亡率增加,侵袭能力下降,化疗敏感性增加。其细胞增殖抑制率为73.86%,凋亡率为35.90%,侵袭能力抑制率约63.51%,空白对照组的卡铂:IC50为80.55±1.05ug/ml,与其相比,Tie2-siRNA组的卡铂IC50下降明显,仅为29.95±0.68ug/ml。
结论本实验说明体外下调Tie2基因的转录及表达可抑制肿瘤生长,抑制其侵袭能力,促进凋亡,并增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,为以后的体内实验奠定基础。