研究目的乳腺癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤,也是一种基因学上异质性的疾病,这种基因的异常又决定着肿瘤的特性,同时也是决定其临床进展行为的基础。明确决定乳腺癌进展、转移的关键基因,将有助于设计有效的预防和治疗药物。如果决定复发和转移危险性的关键基因在原发肿瘤诊断时即可得到评定,将有助于设计个体化的预防和治疗方案。所以,发现决定乳腺癌发生与进展的关键基因已经成为世界范围内急需攻克的科研难题。目前有关乳腺癌基因发病机制的研究多聚焦于家族性乳腺癌以及与其发病密切相关的BRCA1 (Breast cancer 1, early onset)和BRCA2 (Breast cancer 2, early onset)基因缺陷,但约90%罹患乳腺癌的女性是由与BRCA1或BRCA2基因缺失无关的非家族性乳腺癌发展而来,其基因发病机制尚不明确。2002年,美国研究者发现了一种新的乳腺癌抑制基因DBC2 (deleted in breast cancer 2),亦命名为RhoBTB2,并推测DBC2在大多数乳腺癌中表达缺失或处于失活状态,更重要的是,它是与90%的散发性即非家族性乳腺癌密切相关的少数基因之一。初步的研究显示,DBC2基因在多种乳腺癌细胞系和肺癌细胞系中表达缺失。遗传学分析发现,DBC2基因在近10%的乳腺癌中发生了纯合性缺失或点突变等明显的基因改变,而同样位于这一区域的、在正常乳腺组织中表达的基因DBC1及TNFRSF10B均未发生明显的突变,因此DBC2被视为乳腺癌的候选肿瘤抑制基因。虽然DBC2的抑癌基因作用得到了初步认识,但其详细作用机制目前尚不完全清楚。DBC2基因的发现及研究对于阐明散发性乳腺癌及其它肿瘤的发病机制有着极其重要的意义。目前,DBC2的基因定位、蛋白结构及组织表达模式已基本明确,但其作为抑癌基因的功能及作用机制的研究很少,也存在很大的局限性。虽然DBC2最早是从乳腺癌中克隆出来的抑癌基因,然而迄今为止的研究对DBC2在肿瘤组织,尤其是散发性乳腺癌组织中的表达状况仍然一无所知。DBC2通过何种方式发挥抑癌基因的作用?其表达变化能从哪些方面引起细胞功能学的改变?DBC2在肿瘤组织中的表达缺失与乳腺肿瘤的发生、发展、预后及临床病理之间存在怎样的关联?尚不明确。而另一方面,由于DBC2参与细胞骨架的形成及微管介导的蛋白转运,其在肿瘤病理条件下是否能影响肿瘤细胞的迁移、侵袭和转移?所有这些均是本研究的主要目的和我们需要进一步探讨的焦点问题。本论文从临床病例到体外细胞模型,系统地研究了DBC2在乳腺癌的发生发展中的作用、功能机制及其与患者预后的关系：1.抑癌基因DBC2在非家族性乳腺癌中的缺失表达状况及与患者临床病理的相关性；2.DBC2在乳腺癌患者预后转归中的作用；3.构建DBC2真核表达载体和DBC2稳定转染的乳腺癌细胞系,作为基因功能研究的模型；4.从体外细胞水平研究DBC2对乳腺癌细胞增殖、克隆形成、细胞周期、凋亡及侵袭转移的影响。研究方法一.抑癌基因DBC2在非家族性乳腺癌中的表达状况及其临床意义1.病例资料所有病例标本均取自山东省肿瘤防治研究院及山东大学齐鲁医院收治的乳腺疾病患者,乳腺癌组60例,均为女性首诊可手术的散发性乳腺癌,术前未接受任何治疗。正常乳腺标本30例,取自乳腺良性病变旁正常腺体组织,均经术后病理证实为正常乳腺组织。乳腺癌组发病年龄28～70岁,中位发病年龄46岁。乳腺癌病例术后随访至2009年8月,平均随访48个月,失访4例。2.细胞系及组织标本人宫颈癌细胞系HeLa、人卵巢癌细胞系SKOV3、3AO、人膀胱癌细胞系BIU-87、人胃癌细胞系MGC803、人乳腺癌细胞系MCF-7、SKBR3、T-47D、人胚肺成纤维细胞系HELF-6。新鲜胎儿脑组织取自山东大学齐鲁医院妇产科自然流产胎儿。3. RT-PCR法检测组织标本及细胞系中DBC2 mRNA的表达状况通过RT-PCR法检测8种肿瘤细胞系、正常胚胎组织细胞、60例乳腺癌组织及30例正常乳腺组织中DBC2在mRNA水平的表达状况。4.免疫组化法检测组织中DBC2蛋白水平的表达应用免疫组化方法检测60例乳腺癌组织及30例正常乳腺组织中DBC2在蛋白水平的表达状况。5.统计学方法乳腺癌组和正常乳腺对照组以及不同临床病理类型的肿瘤患者之间DBC2缺失表达率的不同采用Chi-square检验。Kaplan-Meier method用于绘制生存曲线,Log-rank和Gehan-Wilcoxon检验用于分析DBC2表达与肿瘤患者生存时间的关系,Cox比例风险回归用于多因素生存分析。二.DBC2真核表达载体的构建及阳性细胞系的筛选1.真核表达载体的构建：运用RT-PCR技术扩增DBC2基因DNA片断,经纯化回收,将DBC2基因片断与克隆载体pMD19-T simple vector连接,转化至感受态E.coli JM109大肠杆菌中,并进行纯化、酶切鉴定及测序。将测序正确的目的基因DBC2亚克隆至真核表达载体pEGFP-N1中,构建成重组真核表达质粒pEGFP-N1-DBC2。2.阳性细胞系的筛选：利用脂质体法将质粒转染入T-47D细胞：转染分以下三组进行：①pEGFP-N1-DBC2转染组；②pEGFP-N1空质粒转染组；③单纯脂质体对照组,通过有限稀释法筛选阳性单克隆细胞,并对稳定转染的细胞系进行RT-PCR及Western Blot鉴定。三.外源性DBC2过表达对乳腺癌细胞恶性行为的影响1.MTT法细胞增殖抑制的检测：取对数生长期的不同处理组T-47D细胞,调细胞浓度为3×104/ml,分别接种于五块相同的96孔板,置于培养箱中分别培养0、1、2、3、4天,酶标仪检测A值,绘制动态生长曲线。2.克隆形成实验：将不同处理组的T-47D细胞分别接种于6孔板,200细胞／孔,置于37℃、5%CO2孵箱中静置培养2-3周,甲醇固定细胞及Giemsa染色,显微镜下计数≥50个细胞的克隆数,计算克隆形成率。3.流式细胞术检测细胞周期：收集不同处理组的T-47D细胞(～106细胞),70%冷乙醇4℃固定过夜,加入PI染液避光染色30min,上机检测分析。4.HE染色法检测细胞凋亡：将细胞分别接种于铺有玻片的6孔板,置于37℃、5%CO2孵箱培养48h,HE常规染色。5.流式细胞术Annexin V-APC/PI法检测细胞凋亡百分率：收集不同处理组的T-47D细胞,4℃预冷的PBS洗两次,加入5μl Annexin V-APC和10μl PI溶液,室温避光孵育15 min,上机检测。6.细胞侵袭能力的检测：将含10%FBS的DMEM培养基加到侵袭小室的下室,细胞悬液加入侵袭小室的上室,37℃、5%CO2孵箱中孵育72h,拭去上室中非侵袭细胞及ECMatrix胶,染色及显微镜下观察和拍照。每孔加入10%醋酸150μl抽提细胞,酶标仪上检测OD570光密度值。7.细胞迁移能力的检测：除上室中未铺ECMatrix胶及培养时间为8h外,余步骤同侵袭实验。结果一.抑癌基因DBC2在非家族性乳腺癌中的表达状况及其临床意义1.DBC2在胚胎组织、细胞及不同肿瘤细胞系中的表达为了探讨DBC2基因在肿瘤发生和发展中的作用,我们首先通过RT-PCR法检测了该基因在8种不同的人肿瘤细胞系及正常人胚胎组织和细胞中的表达状况,结果显示,DBC2不仅表达于正常的胎脑组织和人胚肺细胞,亦表达于乳腺腺癌(MCF-7、SKBR3)及宫颈癌(HeLa)、卵巢癌(SKOV3、3AO)、膀胱癌(BIU-87)、胃癌(MGC-803)等其它来源的肿瘤细胞系,但在乳腺导管癌细胞T-47D中表达缺失,提示DBC2可能与乳腺导管癌的发生有关。2.DBC2在正常乳腺及乳腺癌组织中的表达上述结果显示,在我们检测的所有肿瘤细胞系中,DBC2仅在部分乳腺癌细胞中表达缺失。为进一步探究DBC2在原发性乳腺癌组织中的缺失表达状况,本研究分别采用RT-PCR技术及免疫组化方法检测了60例乳腺癌组织和30例正常乳腺组织中DBC2的表达状况。(1)DBC2在正常乳腺及乳腺癌组织中mR_NA水平的表达检测RT-PCR结果显示,30例正常乳腺组织中有28例可检测到DBC2 mRNA水平的表达,而60例乳腺癌标本中有36例表达缺失,两组的缺失表达率有明显差异(6.7% versus 60.0%, P<0.001)。(2)DBC2在正常乳腺及乳腺癌组织中蛋白水平的表达检测基于RT-PCR的结果,我们进一步检测了DBC2蛋白水平的表达,免疫组化结果显示,DBC2表达于乳腺上皮细胞的胞浆中,阳性结果呈棕黄色染色。几乎所有正常乳腺组织均有表达(28／30),而乳腺癌组仅有24例可检测到DBC2的弱阳性表达,其表达水平明显低于正常乳腺组,其余36例标本均为阴性。这与RT-PCR的检测结果相吻合。3.DBC2的表达缺失与患者临床病理的相关性分析本研究中我们将乳腺癌组按照不同的临床病理资料进行分类,以期发现DBC2的表达缺失与患者临床病理因素之间的相关性。统计结果显示,DBC2的缺失表达与患者的发病年龄、孕激素受体(PR)的表达以及肿瘤的病理类型密切相关。年龄之50岁的患者与年龄<50岁的患者相比,DBC2的阴性率更高(90.0%versus 45.0%, P=0.000); PR阳性患者的DBC2缺失率也明显高于PR阴性的患者(72.2%versus 41.7%,P=0.018)。此外,不同肿瘤亚型DBC2的缺失率也不同,与浸润性小叶癌相比,DBC2的高频缺失更易发生在浸润性导管癌(28.6% versus71.4%,P=0.000)。这一结果与DBC2在不同肿瘤细胞系中的表达检测相一致,即DBC2缺失表达的乳腺癌细胞系T-47D来源于一位54岁、雌激素和孕激素受体均表达阳性的女性乳腺浸润性导管癌患者。但是DBC2的表达与患者的临床分期、腋窝淋巴结转移、雌激素受体(ER)以及HER2受体的表达无相关性。4.DBC2在乳腺癌中的表达状态与病人预后的关系本研究对56例乳腺癌病例(4例失访)进行了术后随访,并通过Kaplan-Meier方法和Log-rank检验将DBC2的表达与患者的术后生存率进行了评估,发现DBC2的表达与患者的长期生存百分率密切相关,DBC2阳性患者的生存率显著高于DBC2阴性患者(P<0.05)。通过对包括发病年龄、肿瘤病理类型、临床分期、腋窝淋巴结转移、ER、PR以及DBC2表达在内的多因素Cox回归分析显示,DBC2表达是乳腺癌患者生存的独立预后因素,DBC2表达缺失的乳腺癌患者预后不良(相对危险系数,0.090；95%可信区间：0.010-0.806：P=0.03)二.DBC2真核表达载体的构建及稳定细胞系的筛选和鉴定本研究选取DBC2表达阳性的人胚肺成纤维细胞系HELF-6作为DBC2基因的来源,通过RT-PCR方法获取该基因的DNA,经过测序、基因的亚克隆等步骤将目的基因与表达载体pEGFP-N1连接,构建了携带有绿色荧光蛋白和G418抗性的重组质粒,通过脂质体法转染入DBC2表达缺失的人乳腺癌细胞系T-47D,筛选出稳定转染的T-47D细胞,并通过RT-PCR和Western blot方法分别从基因和蛋白水平鉴定了目的基因的表达,为该基因的功能研究建立了良好的细胞模型。三.外源性DBC2过表达对乳腺癌细胞恶性行为的影响1.DBC2表达对乳腺癌细胞形态的影响未进行转染及空载体转染(Mock组)的乳腺癌细胞T-47D生长良好,细胞仍保持原有的生长形态。而DBC2过表达的乳腺癌细胞其数量和形态发生了明显变化：细胞数量减少,胞质丰富,胞质内颗粒增多,细胞多成群、成团排列,有向正常乳腺细胞分化的趋势。2.DBC2对乳腺癌细胞的生长抑制作用为了研究DBC2作为抑癌基因的功能,我们首先通过MTT法检测了DBC2对乳腺癌细胞生长的影响。0、1、2、3、4天五个时间点的细胞动态生长曲线显示,与未处理的T-47D细胞阴性对照组及Mock组相比,目的基因转染组的细胞生长从第二天开始明显减慢,并随生长时间的延长,差异更加显著(P<0.01),而Mock组的细胞生长未受影响。3.DBC2对乳腺癌细胞克隆形成的影响为了进一步评估DBC2表达对乳腺癌细胞增殖的影响,我们检测了目的基因转染后乳腺癌细胞克隆形成能力的改变。与正常细胞不同,肿瘤细胞具有在培养介质中形成克隆的倾向和能力,克隆样生长也是恶性肿瘤的基本特征之一。我们的研究发现,DBC2具有抑制乳腺癌细胞克隆形成能力的作用。过表达DBC2转染组T-47D细胞的克隆形成率及所形成的克隆大小均明显低于阴性对照组和空载体Mock组。与Mock组相比,其克隆形成率仅为26%±4.24%(P<0.01)。4.DBC2对乳腺癌细胞周期的影响上述实验结果表明,DBC2可通过抑制乳腺癌细胞的增殖和克隆形成能力而阻抑细胞的恶性生长。为探究这种生长抑制的机制,我们检测了DBC2对肿瘤细胞周期的影响。流式细胞检测结果显示,外源性DBC2的表达可显著抑制乳腺癌细胞周期的演进。与阴性对照及Mock组相比,DBC2转染组出现了明显的G0／G1期比例升高(分别为46.32%,53.92%和80.23%)及S期比例的降低(分别为46.91%,35.54%和11.36%)。这说明D.BC2对乳腺癌细胞的生长抑制作用是通过诱导细胞周期G1期阻滞,从而阻止细胞进入DNA合成期(S期)得以实现的。5.DBC2对乳腺癌细胞凋亡的影响本研究分别采用两种检测方法观察了DBC2对肿瘤细胞凋亡的影响。HE染色形态学观察发现,T-47D对照组及空载体组的乳腺癌细胞仍然保持原有的生长形状,细胞核完整,呈均匀蓝色或淡蓝色,胞浆淡红色。而外源性DBC2过表达的乳腺癌部分细胞变圆,与周围细胞脱离,细胞质密度增加,细胞核固缩、浓染,出现典型的凋亡小体。细胞经Annexin V-APC/PI染色后,流式细胞仪分析结果显示,外源性DBC2的表达可显著促进乳腺癌细胞的凋亡,凋亡率为22.07%±1.67%,明显高于T-47D对照组(8.31%±1.10%)(P＞0.001)和空载体组对照组(11.25%±2.59%)(P<0.01)。6.DBC2对乳腺癌细胞侵袭能力和迁移能力的影响侵袭和转移是恶性肿瘤最显著的生物学特性,肿瘤细胞的侵袭和转移过程涉及到多个阶段和环节,其中最为重要的是对细胞外基质的降解侵袭能力和迁移运动能力。本研究首先利用铺有细胞外基质(ECMatrix)的Transwell系统检测了DBC2对乳腺癌细胞侵袭转移能力的影响。72小时的细胞侵袭实验结果表明,与未转染的T-47D细胞和Mock对照组相比,过表达DBC2的肿瘤细胞侵袭能力无明显变化(分别为0.56±0.06,0.47±0.04和0.50±0.02,P>0.05)。同样,8小时的细胞迁移实验也证明,过表达DBC2的肿瘤细胞迁移能力与未转染的T-47D细胞及Mock组相比,其细胞运动和迁移能力无明显改变(分别为0.53±0.20,0.51±0.10,0.51±0.05,P>0.05)。这与本研究第一部分临床资料的分析结果相吻合,即乳腺癌患者DBC2的表达缺失与患者的临床分期及腋窝淋巴结转移无相关性。结论1.DBC2在散发性、非家族性乳腺癌组织中高频缺失,其基因的失活发生于转录水平。2.DBC2的表达缺失更易发生在50岁以上的绝经妇女和孕激素受体阳性的患者中；浸润性导管癌DBC2的缺失率更高。这说明DBC2可能受雌性激素的调节,其缺失表达在乳腺导管癌的发病机制中发挥重要作用。3.DBC2的缺失与乳腺癌患者的不良预后有关,是影响乳腺癌预后的独立因素。4.DBC2可通过抑制肿瘤细胞生长、降低克隆形成能力、诱导细胞周期G1期阻滞以及促进肿瘤细胞凋亡等方式发挥抑癌基因的作用,但其对肿瘤细胞的侵袭和转移能力无明显影响。创新性及意义1.本研究检测了乳腺癌组织中DBC2的表达缺失状况,并首次阐明DBC2的表达缺失与患者的临床病理及预后转归的相关性。2.本研究首次通过体外细胞功能实验从增殖、凋亡及侵袭转移等方面全面证实了DBC2作为抑癌基因的功能。3.本研究结果为DBC2的后续研究提出了新问题,为以DBC2为靶点的基因靶向治疗和防治策略提出了新思路。