论文部分内容阅读
目的:建立PLVX-CD19-CD28-CD137-TCRl慢病毒载体并进行鉴定,讨论构建的慢病毒载体转染目的T细胞在急性B淋巴细胞白血病中的治疗情况,进一步确定CD19靶向抗原在B淋巴细胞白血病治疗的重要作用,联合CD28、CD137抗原共刺激T细胞,加强T细胞增殖能力,发挥更好的抗肿瘤效果。方法:通过基因工程和分子生物学实验技术构建CD19-28-137-TCRl目标基因序列,通过慢病毒载体与基因序列相结合。通过PCR扩增技术、琼脂糖凝胶电泳检测CD19-28-137-TCRl的表达并对目标基因序列进行验证。将构建好的基因载体用CaCL2法体外转染到293FT细胞中,运用免疫荧光的方法48 h时观察目标载体转染效率和进行慢病毒滴度的计算。通过Weston blot方法检测酶切pLVX-CD19-28-137-TCRl在293FT细胞蛋白中的表达。在云南省第一人民医院血液科寻找1名适合并愿意做CAR-T细胞治疗的B-ALL患者,分离病人T淋巴细胞,用pLVX-CD19-28-137-TCRl慢病毒载体进行体外转染T细胞。将CD19-28-137-TCRl抗体基因导入T细胞。扩大培养建立好的CD19-CAR-T细胞。同时,通过此法由北京免疫治疗研究院构建临床治疗所用CD19-CAR-T细胞,对患者进行细胞回输。治疗后,流式细胞术对病人骨髓细胞流式免疫分型,骨髓活检切片免疫组化分析,电镜观察骨髓细胞来判断临床效应。结果:通过PCR扩增的方法检测到CD19-28-137-TCRl得到稳定的表达。通过CaCl2法成功将慢病毒载体转染到293FT细胞中并得到成功包装。荧光显微镜观察慢病毒对T细胞的转染效率近90%,慢病毒滴度计算结果为5.5X107TU/ml。Weston blot方法检测经过酶切质粒包装后的293FT细胞蛋白以及没有进行酶切质粒的293FT细胞蛋白CD19-CAR基因的表达。结果为β-actin蛋白条带很清晰,经过酶切后的质粒蛋白得到在293FT细胞中得到相对较高的表达,而没有经过酶切的CD19单链抗体基因表达不明显。应用CD19-CAR-T在1例急性B淋巴细胞白血病临床治疗结果中,电子显微镜观察骨髓增生活跃,病人经CAR-T治疗后伴有骨髓纤维化产生。CAR-T治疗后比治疗前淋巴细胞亚群淋巴细胞、粒细胞、单核细胞、原始-髓系前体细胞下降,有核红区域细胞、CD34+占有核细胞上升。免疫组化结果为,CD2、CD3、CD5、CD7、CD19、CD20抗体均为阴性不表达,病变细胞表达TdT,部分表达Pax-5抗体以及Ki-67抗体,结果显示为早期病变的B细胞。结论:成功构建pLVX-CD19-28-137-TCRl慢病毒载体,并经过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定PLVX-CD19-28-137-TCRl慢病毒载体,WB成功检测慢病毒用293FT细胞得到成功包装,病毒滴度相对较高达到5.5X107TU/ml。pLVX-CD19-28-137-TCRl成功转染目的T细胞,且对B淋巴细胞白血病的治疗起到一定的作用,但副作用伴随有骨髓纤维化。